●前言
年6月，欧易/鹿明生物客户郑州大学张旭东教授团队在NatureCommunications期刊发表了题为“的研究成果，通过RNA测序、免疫沉淀、蛋白质组学质谱鉴定等研究方法，表征了3q区域的长链非编码RNAPLANE的功能，揭示了PLANE介导的促进癌细胞增殖和致瘤性的原因，提出PLANE可能构成泛癌背景下的治疗靶点。
中文标题：泛癌lncRNAPLANE调节选择性剪接程序以促进癌症发病
研究对象：细胞系、人组织、小鼠模型
发表期刊：NatureCommunications
影响因子：14.
发表时间：年6月
合作单位：郑州大学
运用关键技术：蛋白质组学质谱鉴定(由鹿明生物提供技术支持)、RNA测序、免疫沉淀、qPCR、免疫荧光
●研究背景
前体mRNA(pre-mRNA)的选择性剪接(AS)是一种基本机制，单个基因可通过这种机制生成不同的成熟转录本，从而增强基因编码能力并增加功能多样性。剪接因子包括丝氨酸-精氨酸(SR)蛋白家族成员和异质核糖核蛋白(hnRNP)，它们通过与外显子或内含子调控序列相互作用来促进或抑制特定剪接事件。异常AS事件通过解除对细胞存活和增殖等基本细胞过程的调节，参与了包括癌症在内的许多疾病的发病机制。
NCOR2作为组装功能复合物的中央组织平台，抑制靶基因的反式激活。NCOR2N端抑制结构域招募其他转录辅助抑制因子，而其C端相互作用结构域与核受体相互作用。值得注意的是，癌细胞中NCOR2的表达常发生改变。此外，研究发现长链非编码RNA(lncRNA)与癌细胞中AS的失调有关。LncRNA主要通过与剪接因子结合、与前体mRNA结合和影响染色质重塑来调节AS。
●研究技术路线
●研究方法及结果
1.E2F1的基因组扩增和转录激活在不同的癌症类型中驱动PLANE上调
作者通过分析TCGA中的lncRNA表达数据，筛选了一组在多数癌症类型中上调的lncRNA。其中MELTF-AS1是扩增频率最高的基因，在五个带注释的MELTF-AS1亚型中，最长的亚型在多种癌细胞系中明显丰富更高。考虑到它与NCOR2的功能关系和对E2F1的转录反应性，作者将其命名为PLANE(Pan-cancerLncRNAActivatingNCOR2responsivetoE2F1)。与相邻正常组织相比，PLANE在LUSC、LUAD和COAD肿瘤中上调（图1a）。此外，在不同癌症类型中PLANE高表达与较差的总存活率（OS）相关（图1b），表明其广泛参与癌症的进展。基因组DNA的qPCR分析表明PLANE拷贝数在LUSC和LUAD中增加（图1c）。与CCC-HIE-2正常人肠上皮细胞系相比，2种癌细胞系中PLANE拷贝数也明显增加（图1d）。绝对定量显示每个A和H细胞分别有~和~个PLANE分子，而每个CCC-HSF-1细胞有~20个PLANE分子（图1e)。
为了深入了解癌细胞中涉及PLANE上调的转录机制，作者使用生物信息学分析了其启动子的转录因子结合位点，预测了位于PLANE基因近端启动子的-/-14区域的多个E2F1结合基序。该区域（E2F1-BR）与内源性E2F1共沉淀并且是PLANE转录上调所必需的（图1f，g）。敲低E2F1减少了内源性PLANE水平，而E2F1的过表达导致PLANE上调（图1h）。
图1
E2F1的基因组扩增和转录激活驱动PLANE在多种癌症类型中上调表达
2.PLANE促进癌细胞增殖和致瘤性
作者接着研究癌细胞中PLANE上调的生物学意义。SiRNA敲低PLANE抑制细胞增殖并降低不同癌细胞系的克隆形成（图2a-c）。在建立的A和H亚系（A.shPLANE和H.shPLANE）中条件敲低了PLANE，以响应强力霉素（Dox）（图2d）。在A.shPLANE和H.shPLANE中，敲低PLANE同样引发细胞增殖和克隆形成的减少，并诱导贴壁非依赖型生长（图2e-g）。此外，nu/nu小鼠的Dox处理延缓了A.shPLANE.1异种移植物的生长（图2h，i）。停止Dox处理恢复了PLANE的表达，并至少部分恢复了体外克隆形成潜力和小鼠肿瘤异种移植物生长（图2f-i），进一步表明了PLANE在致瘤中的作用。
图2
PLANE促进癌细胞增殖和致瘤性
3.PLANE调节NCOR2前体mRNA选择性剪切
为了剖析PLANE促进癌细胞增殖的机制，作者比较了有无PLANE敲低的A细胞的转录组。RNA-seq数据显示NCOR2mRNA变体NCOR2-是敲低PLANE后上调最高的转录本（图3a,b）。相比之下，NCOR2-和NCOR2-的水平都没有发生显著变化（图3a，b）。接着作者通过RNA-seq数据验证PLANE对NCOR2-表达的调节是由NCOR2前体mRNA的AS改变引起的。分析显示在PLANE敲低的细胞中产生NCOR2-和NCOR2-的AS事件频率增加（图3e）。而过表达PLANE减少了NCOR2-和NCOR2-产生的AS事件（图3h，i）。因此，PLANE通过抑制AS产生NCOR2-来抑制NCOR2-的表达。NCOR2siRNA的引入减少了NCOR2的上调，并至少部分逆转了由PLANE敲低引起的细胞增殖和克隆形成的降低（图3j、k）。
图3
PLANE抑制产生NCOR2-的AS事件
4.PLANE与NCOR2前体mRNA形成RNA-RNA双链体
A细胞的ISH分析和亚细胞组分的qPCR分析表明，PLANE主要定位于细胞核（图4a，b），说明其有可能通过与前体mRNA形成RNA-RNA双链体来调节AS。为了测试PLANE是否与NCOR2前体mRNA形成RNA-RNA双链体，作者使用了无细胞测定系统。体外合成的生物素标记的PLANE在NCOR2前体mRNA的内含子45处沉淀了含有PLANE-BR的RNA片段（图4c）。此外，生物素标记的PLANE未能沉淀出不含PLANE-BR的NCOR2前体mRNA片段（图4d）。体外合成的生物素标记的PLANE也从A和H细胞核提取物中沉淀出NCOR2前体mRNA（图4e）。此外，内源性PLANE与PLANE-BR结合，但不与不含PLANE-BR的内源性NCOR2前体mRNA片段结合（图4f）。总的来说，这些结果揭示了PLANE和NCOR2pre-mRNA之间分别通过DFO和PLANE-BR形成了RNA-RNA双链体。
用蛋白酶K处理A细胞的核提取物不会破坏由PLANE和NCOR2前体mRNA形成的RNA-RNA双链体（图4g），表明PLANE和NCOR2前体mRNA之间的结合是直接的，而不是蛋白质依赖性的。然后作者检查了RNA-RNA双链体在PLANE介导的NCOR2前体mRNAAS调节和细胞增殖中的功能意义。与野生型PLANE的过表达相反（图3h，i），将缺乏DFO的PLANE突变体引入A和H细胞对产生NCOR2-的剪接事件和细胞增殖没有影响（图4h，i）。此外，引入shRNA抗性PLANE突变体（PLANE-R）抑制了由敲低PLANE引起的AS事件（图4j，k）。这些发现表明PLANE对NCOR2pre-mRNAAS和细胞增殖的影响需要RNA-RNA双链体的形成。
图4
PLANE与NCOR2前体mRNA形成RNA-RNA双链体
5.PLANE与hnRNPM相互作用
接着作者通过RNA-pulldown和蛋白质谱鉴定了与PLANE相互作用的蛋白质。与PLANE共沉淀的丰度最高的蛋白质是hnRNPM（图5a）。使用RNApulldown和RNA免疫沉淀证实了PLANE和hnRNPM之间的关联（图5b、c）。体外合成的PLANE与重组hnRNPM在无细胞系统中发生共沉淀（图5d），表明PLANE和hnRNPM之间是直接相互作用。
为了确定与hnRNPM相互作用的PLANE区域，作者对体外转录的PLANE突变体进行了分析，结果表明PLANE片段-与hnRNPM共沉淀（图5e）。hnRNPM包含三个RNA识别基序（RRM），分别位于aa72-、aa-和aa-。其中aa-RRM的删除减少了hnRNPM和PLANE之间的关联（图5f），表明hnRNPM的aa-RRM是其结合PLANE所必需的。
图5
PLANE与hnRNPM相互作用
6.PLANE将hnRNPM与NCOR2前体mRNAAS的调节联系起来
作者接下来研究了PLANE和hnRNPM在调节NCOR2前体mRNAAS中的关系。虽然一部分hnRNPM和PLANE与剪接因子SC35共定位，但很少的NCOR2前体mRNA与SC35共定位（图5g）。通过计算机分析，作者在NCOR2premRNA序列中鉴定了多个富含hnRNPM结合位点（hnRNPM-BSs）的片段，其中一个位点包括内含子45。作者用该片段和随机选择的三个含有hnRNPM-BSs的片段（-、-和-）一起进行了RNApulldown和RIP测定评估。结果发现除-外的所有片段都与hnRNPM共沉淀（图6a、b）。敲低PLANE减少了与内含子45内hnRNPM-BS结合的hnRNPM的相对量，但不影响hnRNPM与-和-片段的关联（图6c）。这些结果表明，PLANE特异地促进了hnRNPM与NCOR2pre-mRNA内含子45内的hnRNPM-BS的结合。接着作者发现敲低hnRNPM增强了NCOR2-产生的AS事件（图6d，e），而hnRNPM过表达减少了AS事件，然而敲低PLANE可减少这种影响（图6f，g），表明hnRNPM参与了PLANE介导的NCOR2pre-mRNAAS的调节。总的来说，这些结果表明PLANE促进了hnRNPM与NCOR2前体mRNA的结合，并且是hnRNPM介导的NCOR2前体mRNAAS调节所必需的。
图6
PLANE将hnRNPM与NCOR2前体mRNAAS的调节联系起来
●研究结论
染色体3q远端部分的基因组扩增是恶性肿瘤中最常见的染色体异常之一。本文在功能上表征了3q区域的长链非编码RNA(lncRNA)PLANE，它通过拷贝数增加和E2F1介导的转录激活在不同的癌症类型中上调。PLANE与内含子45处的NCOR2前体mRNA形成RNA-RNA双链体，与hnRNPM结合并促进hnRNPM与内含子的结合，从而导致选择性剪切的抑制，产生NCOR2-。这至少部分是PLANE介导的促进癌细胞增殖和致瘤性的原因。这些结果揭示了PLANE的功能，表明PLANE可能构成泛癌背景下的治疗靶点。
小鹿推荐
本文发现一种位于染色体3q区域的lncRNA，其在不同的癌症中上调，作者将其命名为PLANE。人细胞系和组织样本的研究结果表明，PLANE有助于癌症发展和进展，这是由染色体3q远端部分的基因组扩增和E2F1信号传导的促癌轴驱动的。因此PLANE可能是一个潜在的抗癌靶点。蛋白质组学技术在本文中鉴定了PLANE的相互作用蛋白hnRNPM，为PLANE促癌的机制研究提供了关键调控蛋白，体现了蛋白质组学技术在机制研究中的重要作用。
.
文末看点｜lumingbio
上海鹿明生物科技有限公司多年来，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组学和代谢组学为基础的多层组学整合实验与分析的团队。
欢迎百度搜索鹿明生物——访问鹿明生物