文章介绍
题目：碱基编辑人类类器官中的囊肿形成遗传学揭示了多囊肾病的治疗策略
杂志：CellStemCell
影响因子：IF=23.9
发表时间：年4月
#1
研究背景
Background
正在开发的人类类器官和器官芯片能够更好地了解疾病机制并促进新药的应用。对于以人类基因组为主要治疗靶点的遗传性疾病，动物模型的通量较低，物种之间的差异使得其可能无法完全概括人类状况。简单的人类细胞培养（单层细胞），与组织相比仍然不成熟，缺乏异质细胞性和3D结构。人类类器官和相关系统的出现为各种疾病的这些挑战提供了自然的解决方案。
多囊肾病（PKD）作为最常见的遗传学肾脏疾病，患病率高达1/。PKD具有基因遗传异质性和基因座异质性，主要由定位于16号染色体的PKD1基因（16p13.3）和4号染色体的PKD2基因（4q22.1）突变所致，分别编码多囊蛋白-1（PC1）和多囊蛋白-2（PC2）。目前仅Tolvaptan，一种抗利尿激素拮抗剂，被获批用于PKD快速进展的患者，其可以适度减缓囊肿生长和肾功能下降，但因严重毒性副作用的出现，阻止Tolvaptan的广泛使用。真核生物核糖体选择性糖苷（ERSGs）能够通过核糖体读取无义突变来恢复多囊蛋白的表达，提示其在预防和限制囊肿形成方面的潜在疗效。因此，该研究在类器官模型中挖掘能够预防和限制囊肿的形成，干预PKD发展的新治疗策略。
#2
研究思路
Methods
1、CRISPR碱基编辑建立代表四种常见无义突变的等位基因系列的人类多能干细胞（hPSCs）；
2、hPSCs衍生的PKD类器官模拟PKD的病理过程（囊肿形成和发展），并用于药物ERSGs的筛选和评估（安全些、特异性）。
#3
研究结果
Results
1、CRISPR碱基编辑技术构建带有特定相关无义突变的PKDhPSCs
选择四个PKD无义突变（PKD1-RX、PKD1-QX、PKD2-RX和PKD2-RX），并使用CRISPR碱基编辑技术成功构建了以上无义突变的hPSCs（图1）。
图1利用CRISPR碱基编辑产生具有PKD患者无义突变的hPSCs
2、纯合突变体肾脏类器官自发形成囊肿，模拟PKD
将未编辑hPSCs（control）和无义突变的hPSCs分化为肾单位样肾类器官，所有四种靶向PKD突变的类器官的囊发生率和囊肿生长率相似，均比control组高。通过检测多种标记物，发现具有临床相关突变谱的碱基编辑类器官强能够再现PKD表型（图2）。
图2纯合无义突变肾类器官的PKD模型
3、杂合突变体预防PKD囊肿形成
接下来评估PKD杂合子与纯合子突变类器官的表型，发现与纯合突变体相比，PKD1或PKD2无义截断的类器官杂合突变体在培养数周后也没有显著的囊肿产生率。通过胞嘧啶/腺嘌呤碱基编辑进行校正，发现PKD1或PKD2单拷贝突变不足以诱导人类类器官的囊性表型出现（图3）。
图3杂合突变体防止囊肿的形成
4、ERSGs通过核糖体读取无义突变，减少PKD囊肿形成
检测两种ERSGs——ELX-02和ELX-10在预防和限制四种靶向PKD突变类器官的囊肿形成方面的潜在疗效。经ERSGs处理后，类器官形成囊肿的百分比降至25%以下，显著低于未处理类器官的75%，且囊肿大小呈剂量依赖性减少。此外，安全性分析确定90μM剂量下ELX-02和ELX-10的毒性微乎其微（图4）。
接下来，测试ELX-02和ELX-10是否可以降低预先建立的囊肿的生长速度，结果发现最高剂量下，ERSGs治疗后四种靶向PKD突变类器官的囊肿生长趋于稳定，且均未检测到实质性毒性（图5）。
所有PKD1或PKD2靶突变类器官进行ERSGs（60μM）处理后PC1表达呈剂量依赖性增加，且依赖于PC2。进一步测试以上类器官模型中进行的ERSGs治疗反应是否对无义突变具有特异性，CRISPR构建PKD2纯合缺失突变的hPSCs，并衍生为类器官，结果发现当ERSGs剂量高达30μM时，对缺乏无义突变的PKD2类器官的囊肿形成发生没有影响（图6），提示ELX-02和ELX-10具有靶向活性。
图4预防性通读治疗可防止PKD囊肿形成
图5治疗性通读治疗减缓PKD囊肿扩张
图6ERSGs特异性读取无义突变恢复多囊蛋白的表达
5、ERSGs在PKD小鼠体内积聚于肾脏和多囊肾囊肿中
氨基糖苷能够被肾细胞上皮吸收，但这是否延伸到PKD囊肿尚不清楚。本研究通过使用GTTR荧光基团偶联氨基糖苷，发现在PKD类器官囊肿中，GTTR在数小时内就能摄取到囊壁上皮细胞，且以细胞内定位模式存在于近端和远端细胞中。为了测试GTTR在PKD小鼠体内的积累，将GTTR注射到血管中，取肾脏组织进行进行荧光分析，发现囊肿内膜上皮的一个亚群易积累GTTR（图7）。
图7氨基糖苷定位于PKD小鼠囊肿部位
小结
在PKD中，微观的肾小管在数十年间扩张成宏观的囊肿，进而对肾脏结构和功能会造成不可逆的伤害，最终发展为尿毒症。PKD通过杂合的功能丧失突变遗传，理论上还需要额外的功能丧失。为了验证这一点，本研究使用CRISPR碱基编辑技术，在等位基因序列中建立了代表四种常见无义突变的hPSCs，并使其分化为肾类器官。结果发现，纯合突变体自发形成囊肿，而杂合突变体（原始或碱基校正）无囊肿表型出现。基于以上发现，确定ERSGs作为PKD的治疗药物，以读取这些相同的无义突变。两种不同的ERSGs不仅可以阻止囊肿的形成，还可以通过部分恢复多囊蛋白的表达来限制预先形成的囊肿的生长。此外，类器官和小鼠的囊肿上皮细胞中也有糖苷积累。基于以上研究结果，可将人类多囊蛋白阈值定义为药理学或基因治疗干预的可克服的药物靶点，与了解PKD疾病机制和未来的临床试验密切相关。
参考文献
VishyCE,ThomasC,VincentT,CrawfordDK,GoddeerisMM,FreedmanBS.Geneticsofcystogenesisinbase-editedhumanorganoidsrevealtherapeuticstrategiesforpolycystickidneydisease.CellStemCell.Apr4;31(4):-.e5.doi:10./j.stem..03..PMID:.
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