抗体工业领域，杂交瘤技术和噬菌体展示抗体库技术仍是当前最主要的两项抗体发现技术，两种技术则各有千秋。
抗体发现（AntibodyDiscovery）是在生产工艺开发阶段之前的工作。本文荣幸地邀请了艾柏森谢总经理谢朋辉老师就当前主要的抗体发现技术做一个简单介绍。
抗体发现：杂交瘤技术和噬菌体展示抗体库技术
杂交瘤技术产生，发展和应用
杂交瘤技术产生于年，是整个生命科学发展的一个重要里程碑，为此获得了年诺贝尔生理和医学奖。杂交瘤技术的科学原理和设计非常巧妙。B细胞可以分泌表达抗体，一个B细胞克隆产生一种抗体，即单克隆抗体。但是由于B细胞是一种原代细胞，在体外不能无限传代，所以人们无法在体外有效筛选和生产单克隆抗体。当时，抗体基因克隆、噬菌体展示抗体库和哺乳动物细胞表达抗体等基因工程技术尚未出现，人们迫切需要一种技术，为疾病的诊断和治疗提供单抗产品。
骨髓瘤细胞是一种永久传代的肿瘤细胞，也来源于B细胞。英国的两位伟大的科学家科赫（Kohler）和米尔斯坦(Milstein)，采用仙台病毒作为促细胞融合剂，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠B细胞体外融合，产生出多种同源或异源二倍体或多倍体子代细胞，以及未经融合的亲本细胞。这些细胞中只有异源杂合细胞才能在HAT选择培养基中生存下来，其他细胞在几天后均会死亡。这些异源杂合细胞被称为杂交瘤细胞。这些杂交瘤细胞还可以接种在动物腹腔中产生腹水，这是一种非常简单的抗体生产方式。
即使现在看，HAT选择培养基设计之巧妙也是非常令人赞叹的。细胞DNA合成主要途径必需叶酸作为关键辅酶，次要途径则必需次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在，而且需要次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。HAT培养基中含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)三种成分。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA。HGPRT阳性细胞会在利用8-AG合成毒性核苷酸之后死亡，经毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-AG）筛选出来的HGPRT阴性骨髓瘤细胞株被用于制备杂交瘤细胞。正常的B细胞是HGPRT阳性细胞，所以融合后在HAT选择培养基中，HGPRT阴性的亲本骨髓瘤细胞和其同源二倍体或多倍体子代细胞，因无法合成DNA而死亡；亲本B细胞和其同源二倍体或多倍体子代细胞则是原代细胞，生长几代之后也会死亡。由于传代过程中遗传物资分配不均一，异源多倍体细胞也会死亡。这样，存活下来的细胞大多数是异源二倍体细胞，即杂交瘤细胞。
HAT筛选原理
在此原理基础上，杂交瘤技术又经过不断的改进。目前主要采用PEG(聚乙二醇)作为促融合剂制备杂交瘤细胞，该方法更为有效和稳定。为了提高融合效率，科学家又开发了电融合技术。所谓电融合技术，即通过高频交流电场将B细胞和骨髓瘤细胞有规律的排列在一起，然后施以短暂的高压方波脉冲，穿透细胞膜，依次导致细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合，制备出杂交瘤细胞。而电融合的效率一般是PEG融合的10倍以上。
从动物选择上看，最初杂交瘤技术是制备大鼠和小鼠杂交瘤细胞，主要是因为获得了稳定和高效的大鼠和小鼠的骨髓瘤细胞适合用于杂交瘤制备。后来，人们又陆续开发了合适的兔骨髓瘤细胞和人骨髓瘤细胞。但由于骨髓瘤细胞的知识产权、融合稳定性，以及伦理因素（人杂交瘤）等原因，兔杂交瘤技术和人杂交瘤技术没有被广泛推广。
杂交瘤技术的产生极大促进了单克隆抗体产品的开发。在现代科学研究、疾病诊断和治疗和工业生产等多个领域，单克隆抗体和其相关产品都具有不可替代的作用。即使基因工程抗体技术发展非常成熟的今天，杂交瘤技术仍然具有不可替代的作用。
噬菌体展示抗体库技术
上世纪80年代末，噬菌体展示技术、PCR技术和基因工程抗体技术相结合，产生了噬菌体展示抗体库技术。
将全套抗体重链和轻链基因分别克隆出来，再以单链抗体（scFv）、单域抗体（VH或VL）或Fab抗体的分子形式，与噬菌体颗粒的结构蛋白（主要是P3蛋白）融合表达，并展示在噬菌体颗粒的表面。
由于在噬菌体颗粒的表面展示抗体，内部含有抗体基因，所以完成了功能表型和基因型的偶联或统一，进而允许采用亲和淘选的方式，通过抗原和抗体特异结合这一表型筛选获得抗体基因。由于构建抗体库的基因来源于混合后B淋巴细胞的裂解物，所以不同B细胞克隆的重链和轻链基因又发生了组合配对，因此又称为组合抗体库技术。
噬菌体抗体库筛选示意
在噬菌体展示技术的基础上，后来又产生了以核糖体展示为代表的体外展示技术，以酵母展示为代表的细胞表面展示技术，这些技术也主要被用于抗体库的构建和筛选。这些技术改变的是基因型和表型的偶联方式，没有改变组合抗体库这一本质特征。混合单细胞抗体基因扩增技术和原位抗体片段基因制备技术结合，才能真正构建天然配对抗体库，但目前天然配对抗体库技术尚未成熟。
各有千秋
抗体工业领域，杂交瘤技术和噬菌体展示抗体库技术仍是当前最主要的两项抗体发现技术。两种技术则各有优势和劣势。
杂交瘤技术的优势在于：
（1）小鼠或大鼠易于饲养和免疫。有效免疫是筛选高亲和力抗体的保障，杂交瘤和小鼠/大鼠免疫抗体库是获得高活性小鼠抗体的有效手段。
（2）由于细胞融合操作简单而且稳定，仅需要细胞培养知识及技术和试验条件，无需分子生物学相关技术和条件，就可以获得单克隆抗体。以开发科研或诊断用单克隆抗体为目的时，门槛相对较低，更易于推广和普及。
（3）将小鼠杂交瘤细胞输入到小鼠腹腔内，就可以生产单克隆抗体，方式非常简单，也非常有利于开发科研或诊断用单克隆抗体。当然，现在对科研或诊断抗体的生产也在逐步要求体外细胞培养生产，以保证无动物源成分。这就要求克隆杂交瘤抗体的基因，并采用哺乳动物细胞表达系统来生产重组单克隆抗体。
（4）噬菌体展示抗体库采用大肠杆菌作为表达宿主，采用单链抗体（scFv）、单域抗体（VHH）或Fab抗体等非天然抗体分子形式。抗体的结构和功能远不如哺乳动物细胞表达的抗体产品。在实践中，抗体产品的分子形式主要是哺乳动物细胞表达生产的IgG。噬菌体展示抗体库筛选的抗体在分子转换成IgG之后，即使采用哺乳动物细胞表达生产，也会出现部分克隆活性降低和丢失的现象。而杂交瘤细胞就是一种哺乳动物细胞，其分泌的单克隆抗体是天然的IgG分子形式。因此杂交瘤单克隆抗体产品稳定，无需分子改造，可以直接应用于除疾病治疗之外的大多数领域，而且在筛选过程中，即使在小鼠IgG和人IgG之间分子转换，也很少出现活性降低和丢失的现象。
（5）杂交瘤单克隆抗体的重链和轻链是原始B细胞的天然配对。从组合抗体库中筛选的非天然配可能影响抗体的活性和稳定性。
与噬菌体展示抗体库技术相比，杂交瘤技术的劣势主要体现在：
（1）针对动物毒性抗原、自身抗原、免疫耐受原和弱免疫原性抗原，由于无法产生有效免疫，故而不适合采用杂交瘤技术来制备抗体。可以采用通用天然抗体库、合成或半合抗体库筛选这类抗原的抗体。
（2）细胞融合后，产生的候选克隆数量少。即使采用电融合技术，候选克隆一般最多达到10^4个，而抗体库的容量可以达到10^10以上。同等免疫条件下，候选克隆越多，越容易筛选出高活性抗体。
（3）作为异源杂合二倍体细胞，候选杂交瘤克隆需要亚克隆后才能稳定。不及时亚克隆的候选杂交瘤细胞不稳定，容易丢失阳性克隆。而挑选阳性克隆，尤其是复杂的功能筛选，需要一定的时间窗口，窗口越长，功能筛选越成熟和可信。微量冻存候选克隆可以延长功能筛选时间窗口，但功能检测需要足够量的抗体蛋白，因此批量亚克隆仍然需要大的工作量。
杂交瘤筛选失败后的应对方案是重新免疫或者重新融合（也受限于免疫后小鼠的饲养周期），必然产生时间成本。相比而言，抗体库一旦建成，就可以无限期保存。筛选时仅需取出少部分噬菌体颗粒，原始噬菌体库就足以应付反复筛选，无需重新建库。此外，亲和淘选的方式既可以特异性富集结合抗原的抗体，还可以尽量扣除与对照蛋白结合的抗体，有效提高筛选效率。抗体库亲和筛选结合大规模测序技术还可以充分扩大筛选规模。
（4）抗体的重链和轻链重新组合配对，也可能优化抗体性能，这也是组合抗体库的一个优势。
（5）出于伦理考虑，限制了人杂交瘤技术的发展和应用。通常杂交瘤单克隆抗体是动物抗体，用于开发药物必需将抗体进行人源化改造。
对免疫转基因人源化小鼠，也可以采用杂交瘤技术制备全人源抗体。但是转基因人源化小鼠技术具有较高的技术和很强专利门槛，目前为止还无法推广。
相比而言，全人源抗体库则允许直接筛选全人源抗体，无需人源化，而全人源抗体目前是抗体药物开发的优选。
（6）抗体库是一项基因工程技术，杂交瘤是一项细胞工程技术，因此可以利用现代分子生物学知识和技术，构建鸡、兔、骆驼、羊驼、鲨鱼等动物的免疫抗体库，解决因无可用骨髓瘤细胞而无法制备此类动物杂交瘤单克隆抗体的难题。
未来趋势
结合杂交瘤技术的原理和特点，不难理出其发展趋势。
首先，可以肯定仍然聚焦小鼠/大鼠杂交瘤领域。随着转基因人源化小鼠（或大鼠）技术的推广，利用杂交瘤技术筛选全人源抗体将进一步发展。
其次，免疫仍是成功筛选杂交瘤单抗的关键。尤其是复杂膜蛋白免疫和打破免疫耐受等技术难题将会是攻关的重点。
最后，应用高通量克隆挑选及鉴定技术和设备，扩大筛选规模，也是以金钱换时间的策略，在抗体药物开发领域还会不断推陈出新。微量冻存候选克隆、快速单细胞克隆抗体基因和高通量表达和纯化重组抗体等技术的积累和突破，结合先进设备的使用，是发展趋势之一。
总之，将抗体筛选与抗体应用紧密联系在一起，会是未来杂交瘤技术发展的最基本考量。
QA
1.杂交瘤技术筛选抗体的难点主要在哪里，比如是在筛选的通量吗？企业和研究者应该如何选择高通量筛选的设备和方法呢？
企业和研究者首先需要解决高效免疫和高效融合技术难题，这是基础。
然后采用有限稀释，可结合自动化移液工作站，或采用其他方法（流式，自动克隆挑取等）做克隆化培养，再建立高通量蛋白结合检测方法（ELISA,SPR），高通量细胞结合检测方法(流式或多重荧光检测等)，来挑选目标克隆。也可以采用一些新近出现的微流控或细胞光导系统做整合平台。
企业可综合考虑内部能力和项目情况选择适合的方法和设备，也应避免昂贵的设备长期闲置造成的浪费，这种现象在我和师兄（编者注：拓澳生物员工）聊起时，发现相当普遍。就我自己的例子而言，每年也都有一些杂交瘤的项目，目前用一些常规的设备基本足以应付。
2.通过杂交瘤，噬菌体展示或其他抗体发现技术找到分子之后，接下来的工作流程大概是怎样的？
抗体优化，即人源化，亲和力成熟，去除T细胞表位等；抗体鉴定，亲和力测定，表位鉴定，体外和体内功能检测和鉴定等。
抗体制备，建立稳定细胞株，建立生产工艺，中试生产等。
临床前试验，药理，毒理药代等。
可参考下图的大致流程。
生物药研发到生产的大致流程示意。图片来源：丁香园
3.外源基因转染到工程细胞如CHO细胞后，对转染pool的细胞进行分离筛选和建株，此时监管部门要求提供单克隆源性（monoclonality）的证据，请问此时的情况和杂交瘤细胞分离时有什么不同？
首先不要混淆两个不同的工作阶段和目的。抗体发现是找到有功能的抗体的序列，用于后续的抗体优化直至得到外源基因（GOI),此时没有监管部门要求提供杂交瘤的“克隆源性”；细胞株开发则已进入CMC阶段，将得到的外源基因转染到工程细胞中，筛选和建立稳定高效表达的细胞株用于未来生产，此时监管部门要求必须提供细胞株的单克隆源性证据。
在杂交瘤筛选候选抗体时，如果杂交瘤细胞株不是单克隆，或者骨髓瘤细胞中还有其他重链或轻链基因，在克隆抗体基因之后需要重新组合配对各个重链和轻链，表达重组抗体进行验证。
在鉴定杂交瘤抗体活性的过程中，需要尽量及早亚克隆，否则细胞上清中的抗体分泌量降低，影响抗体鉴定。为了长期保存杂交瘤细胞株和利用小鼠腹水法或体外培养法生产抗体，也需要筛选到稳定的单克隆。因为多克隆杂交瘤细胞在扩增过程中，抗体的分泌量会降低。
上图局部示意：抗体发现（AntibodyDiscovery）和细胞株开发（CellLineDevelopment）是不同阶段的工作，其各自的目的和要求不同。