本周，宾夕法尼亚大学JasonBurdick课题组在NatureCommunications上发表了题为“3Dbioprintingofhighcell-densityheterogeneoustissuemodelsthroughspheroidfusionwithinself-healinghydrogels”的文章。
摘要：需要细胞模型来研究人体发育和体外疾病，并筛选药物的毒性和功效。当前的方法在功能组织模型的工程设计中受到限制，这些模型具有必要的细胞密度和异质性以适当地建模细胞和组织行为。在这里，研究者开发了一种生物打印方法，可将球状体以高分辨率打印到自愈支持水凝胶（悬浮胶）中，从而使其图案化并融合到规定空间组织的高细胞密度微组织中。该种方法生物打印的诱导多能干细胞衍生的心脏微组织模型，可实现对心肌细胞和成纤维细胞比值控制，以复制心肌梗塞后出现的瘢痕性心脏组织的结构和功能特征，包括收缩力下降和不规则的电活动。将生物打印的体外模型与功能读数结合，以探究各种促再生microRNA治疗方案如何影响组织再生以及由于心肌细胞增殖而恢复的功能。该方法可用于一系列生物医学应用，包括开发精确模型以模拟疾病和筛选药物，特别是在高细胞密度和异质性很重要的情况下非常有意义。
文章简介
打印方法：为使可控的球状体图案化，开发了一种在自愈支持水凝胶内生物体化球状体的方法，该方法包括：（i）真空抽吸介质储器中的球状体，（ii）将球状体直接转移至由于其剪切变稀特性而支持水凝胶（悬浮胶），以及（iii）球状体在水凝胶中的任何位置沉积，并具有真空去除功能和水凝胶的自修复功能（图1a）。通过在两个容器之间进行球体运输的狭窄通道，将包含球体的培养基容器与包含支持水凝胶的第二容器分离，可以实现此过程。该方法避免了当在液体和空气界面之间转移细胞和球体时可显着降低细胞生存力的表面张力效应。所用的载体水凝胶是基于用金刚烷（Ad）或β-环糊精（CD）修饰的透明质酸（HA）的组装物，其剪切稀化和自我修复特性如下所示：水凝胶粘度随剪切速率的增加而降低，并在高应变到低应变的循环中恢复了储能模量（图1b）（Burdick组已经基于此种材料发表多篇文章，感兴趣的可以去调研了解）。
打印后24小时内评估了球体中细胞的活力。在较低的聚合物浓度（3和5wt％）下，发现细胞活力高（90–95％），而在最高的聚合物浓度（7wt％）下，细胞活力显着下降（87％）。较低的聚合物浓度可能会降低球体平移过程中剪切力的影响，从而提高细胞活力。由于在所有聚合物浓度下均具有较高的生物打印精度，并且在低聚合物浓度下具有最高的细胞活力，因此3wt％的水凝胶用于所有后续研究。
当球状体通过直接接触进行生物印刷时，在培养的四天中观察到融合（图3b）。另外，当以50m的分离距离对球体进行生物打印时，观察到可比较的融合水平（图3b）。利用这些特性，接下来将8个球状体沉积成环形，在培养4天后可将其连续融合成微组织环（图3c）。可以用多层球体重复此过程，以形成微组织管（图3c）。重要的是，由于支持水凝胶中交联的非共价和可逆性质以及柔软的水凝胶机械性能（GPa），因此可以轻轻吸去支持水凝胶以从融合的微组织中去除。
心肌纤维化模型
准确复制心脏疾病病理生理学的工程组织模型是一个领域挑战。几乎所有心脏病都涉及由CF增殖和ECM沉积引起的病理性纤维化重塑。CF本身无法产生动作电位，并且过多的ECM产生会减少心肌细胞-心肌细胞（CM）的连通性，从而导致组织顺应性降低和电同步。MI后发生的局灶性心脏纤维化是主要的临床负担，通常会导致一系列病理重塑，并可能导致心力衰竭。工程组织模型可以复制这些病理特征的各个方面并允许研究修复机制，可以为开发治疗性干预措施提供有价值的工具。
为了满足这一需求，研究者使用球状生物打印技术设计了一种局灶性心脏纤维化的简化模型。为了模拟健康和纤维化的心脏组织，通过将iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）和CFs以不同的比率（“健康”的iPSC-CM与CFs的比例为4：1；将iPSC-CMs与CFs的比例为1：4）制成球状体CF为“疤痕”），这通过对心脏肌钙蛋白T（cTnT）（CM标记）和波形蛋白（CF标记）的免疫荧光染色进行了验证（图4a）。iPSC-CM是用于心脏球体研究的常见CM来源。对α-肌动蛋白的免疫荧光染色还显示出健康球体中牢固的肌节形成，而瘢痕球体中的染色有限。与3天的疤痕对照组相比，健康的球体的收缩幅度显着增加，并且趋向于更快的峰间时间ms（70bpm）（图4b）。光学映射细胞内Ca2+显示健康球体中的Ca2+通量稳定且同步，而在瘢痕球体中仅观察到较低水平的Ca2+通量，且仅散在的零星岛。量化了心脏细胞周期的关键参数，包括钙瞬变持续时间（CTD）（ms），峰峰值时间（ms）和钙通量幅度（F/Fo）。健康球体的CTD和钙通量振幅显着较高（图4c），健康球体的峰值时间显着降低（即更快的去极化）（图4c）。总之，这些结果表明，心脏球体中CM：CF比率的变化允许创建健康和疤痕累累的心脏组织模型。
为了模拟局灶性心脏纤维化，作者使用了生物打印技术，通过健康和疤痕状球体的定向融合来创建心脏组织的异质环。环形结构用于模拟心腔的组织水平电生理特性，包括再次出现心律不齐的可能性。为了对健康的心肌建模，对直接接触的8个健康球体的环进行了生物打印，而对有疤痕的心肌模型进行了7个健康球体和1个瘢痕性球体的环的生物打印（图5a）。培养5天后，对cTnT和波形蛋白双重染色证实了相邻球体之间的融合，并且在疤痕微组织中观察到了高成纤维细胞密度的区域。活死染色显示融合5天后具有高细胞活力，并且iPSC-CM与CF的比例在培养期间保持不变。在微组织的健康区域也观察到了健壮的肌节染色，在疤痕区域观察到了较低的水平。另外，连接蛋白-43在细胞边界处的染色表明在微组织的健康区域中间隙连接的形成，而在疤痕区域中发现的染色水平较低（图5a）。微组织环也以连续和同步的方式收缩，从支持水凝胶中取出后可以观察到（图5b）。微组织收缩的定量揭示了与健康对照组相比，疤痕微组织收缩幅度减小的趋势（图5b），模仿了心肌梗死后整体收缩力的降低。
为了确定miRNA处理是否能促进瘢痕状球体中CM和CF的增殖，我们在7天时进行了EdU标记（一种增殖标记）以及cTnT和波形蛋白染色的共染色（图6b）。存在cTnT+EdU+岛，表明增殖和克隆扩增（图6b），尤其是治疗时间较长（0-4天，0-7天）的情况。没有观察到Edu+细胞的数量增加，表明miRNA处理主要影响CM增殖。在健康的球体中也观察到类似的趋势，随着cTnT数量的增加与对照组相比，在所有治疗条件下均观察到Edu+细胞，对CF增殖的影响有限。
总结
生物打印技术的进步使得能够开发出能够更好地模仿天然组织和器官复杂性的体外模型和可植入结构。这些技术中的许多技术都依赖于处理嵌入水凝胶中的细胞悬浮液，这给工程改造具有天然组织样细胞密度和异质性以及所产生功能的组织带来了挑战。在这里，研究者开发了一种能够对高细胞密度组织模型进行3D生物打印的过程，并且可以精确控制微组织结构和局部异质性。这可以通过应用自愈水凝胶来实现，该凝胶支持3D空间中生物打印的球体的生物组装和融合，以形成连续的细胞密集的组织模型。通过对心脏微组织疾病模型进行生物打印来证明该方法的潜力，该模型概括了MI后出现的病理性瘢痕形成特征，并使用心脏功能的读数（收缩，电生理同步），能够探查修复的miRNA治疗方法。该方法具有很高的通用性，可与各种球体和类器官系统一起实施，这为精确模型的3D生物打印提供了许多机会，以模拟疾病和进行药物筛选。
参考文献
Daly,A.C.,Davidson,M.D.Burdick,J.A.3Dbioprintingofhighcell-densityheterogeneoustissuemodelsthroughspheroidfusionwithinself-healinghydrogels.NatCommun12,().