摘要
人类小脑的功能多样性在很大程度上被认为更多地来自于其广泛的联系，而不是局限于其部分不变的结构。然而，小脑内在组织中连接的确定是否以及如何与微尺度基因表达相互作用仍不清楚。在这里，我们通过研究同时连接小脑功能异质性及其驱动因素的遗传基质，即连接因素，来解码小脑功能组织的遗传图谱。我们不仅鉴定了个网络特异性基因，而且还发现它们的共表达模式与小脑内功能连接（FC）密切相关。其中90个基因也与皮质-小脑认知-边缘网络的FC有关。进一步发现这些基因的生物学功能，我们进行了“虚拟基因敲除”，通过观察基因之间的耦合和FC以及将基因分成两个子集，即，一个涉及小脑神经发育的阳性基因贡献指标（GCI+）和一个与神经传递有关的阴性基因集（GCI?）。一个更有趣的发现是，GCI?与小脑连接-行为关联显著相关，并与许多公认的与小脑功能异常密切相关的脑部疾病密切相关。我们的研究结果可以共同帮助重新思考小脑功能组织背后的遗传底物，并为神经精神疾病中涉及小脑的高阶功能和功能障碍提供可能的微宏观相互作用的机制解释。
1.引言
来自动物和人类研究的证据共同促进了我们对人类小脑的理解，人类小脑参与运动、复杂的认知和情绪行为。而小脑的这种功能多样性被认为更多地来自于其与小脑外结构之间的广泛的传入和传出连接，而不是局限于小脑-皮质细胞结构的一个规则的网叶状解剖特征。考虑到人类神经系统的宏观功能组织最终受潜在的微观基因表达调控的广泛理解，因此揭示小脑功能组织背后的基因谱是很有趣的。到目前为止，尚不清楚的是，小脑内在功能组织中连接的假设确定是否以及如何与微尺度基因表达相互作用。
迄今为止，支持人类小脑功能组织的遗传机制主要尚不清楚。只有少数研究试图调查人类小脑的基因表达模式，但他们提供了基因表达变异性的不一致的结果。例如，Hawrylycz等人和Negi和Guda都发现，在整个健康成人小脑的解剖区域中，基因表达是高度同质的。相比之下，Aldinger等人和Wang和Zoghbi发现，小脑的发育和功能受分子和细胞程序的精确调控，基因表达模式在空间和时间尺度上是异质的。此外，在小鼠小脑中发现了高通量单核RNA-seq，小脑回和沟之间基因表达模式的差异以及包含特定细胞类型的小脑区域特异性。
因为显示同质性的相关研究探索了小脑整体宏观解剖边界（如小脑小叶）的整体小脑遗传表达模式，这可能未能充分反映人类小脑的功能组织。小脑遗传变异的这种不一致性有待进一步探索。
在过去的十年中，人们提出了使用任务和无任务功能磁共振成像（fMRI）来描述人类小脑组织的功能拓扑图，特别是单独的小脑功能网络和小脑内功能梯度。特别是，Buckner等人采用了静息态功能小脑-皮层回路的连通性（FC）作为绘制人类小脑内在功能结构的工具，并提出了一种可能的功能分割成7个网络和17个网络。因此，通过研究连接小脑功能异质性及其驱动因素的分子遗传底物，即连接，可以解码小脑功能组织的遗传谱。一种很有前途的方法是影像-转录组学关联分析，它允许结合宏观神经成像表型对微观转录组数据进行全脑空间分析。此外，它还提供了通过神经成像将转录组数据与行为变化联系起来的机会。这些跨尺度分析可以更好地理解微观基因表达和宏观功能网络之间的相互作用，并最终参与个体行为，重要的是，它们被认为在小脑相关疾病存在的多尺度相互作用。
因此，我们的目标是研究人类小脑功能组织背后的神经生物学遗传底物。更具体地说，我们将寻求解决以下三个渐进式的问题。在不同的细胞结构基本不变的小脑内功能网络中是否存在差异表达的基因？基因表达和小脑连接是如何相互联系的，这种联系与人类行为以及大脑疾病之间有任何联系吗？在目前的研究中，我们首先通过差异基因表达分析来检测不同的小脑功能网络，这些网络的细胞结构基本不变。这一分析使我们能够进一步研究小脑功能异质性和细胞近同质性结构之间不一致的遗传学解释。然后，为了探究这些网络特异性基因与小脑连接之间的关系，我们利用网络特异性基因构建了基因共表达矩阵，发现其与小脑内和小脑-皮层认知-边缘FC高度相关。此外，我们通过虚拟基因敲除（KO）检测了每个网络特异性基因对这种相关性的贡献，并将网络特异性基因分为两个子集，即阳性基因贡献指标（GCI+）和阴性基因集（GCI?）。我们发现GCI+似乎主要参与小脑神经发育。而GCI?似乎与神经传递、情绪-认知行为有关，并在与小脑功能异常密切相关的各种神经精神疾病中显著丰富。总之，目前的探索为将功能网络的遗传和行为标记与小脑参与各种神经精神疾病的高阶非运动功能和功能障碍联系起来提供了一个起点。
2.材料和方法
实验设计的原理图如图1所示，包括三个步骤。步骤1（图1A）：为了研究网络特异性基因是否在小脑功能网络中发生，我们结合Allen人脑图谱（AHBA）转录组数据和小脑功能分割图谱进行了差异基因表达分析。步骤2（图1B）：然后，利用第1步中的网络特异性基因构建共表达矩阵，并与FC进行比较，探讨其整体相关性（为简单起见称为Gene-FC相关性）。同时，还对基因与小脑-皮质FC之间的关系也进行了探讨。步骤3（图1C）：利用“虚拟基因敲除”来检查每个基因对Gene-FC相关性的贡献方向，并用于将网络特异性基因分离为两个子集。此外，我们应用了一系列的功能注释工具来探索这些基因的作用，包括基因富集分析、行为-FC-基因定位分析、疾病富集分析和整合时间特异性分析。
图1.分析流程。A.步骤1：基因表达差异分析。我们将AHBA小脑样本划分为7个小脑功能网络（左），并分别平均每个基因在同一网络中的表达。然后，我们用limma（中）以差异倍数（foldchange）1和p0.05（FDR校正）的基因表达进行比较（红色表示基因在视觉网络中显著正表达）。因此，我们获得了7个网络的网络特异性基因（右）。B.步骤2：基因共表达与FC之间的相关性包括小脑内和小脑-皮质回路。小脑内：对于每对网络，我们利用小脑网络特异性基因计算它们之间的基因表达相似性，然后构建基因共表达矩阵。FC矩阵是通过关联所有成对的BOLD信号来构建的。然后评价了遗传相关与功能相关之间的关系。小脑-皮层回路：我们首先定义了皮质网络特异性基因，就像我们对小脑所做的那样，并测试是否发生了任何收敛性差异表达的基因。然后利用重叠基因获得每个小脑网络的皮层遗传相关性，并评估每个小脑网络的皮层遗传和功能相关性之间的关系。C.步骤3：功能注释包括虚拟基因敲除（KO）、行为-FC-基因定位、基因富集分析和生命周期特异性分析。
2.1AHBA预处理
AHBA是一个公开的转录组数据集（