苯甲酸地那铵是已知的最苦的药，有什么用呢？
最近，来自比利时鲁汶大学的IngeDepoortere团队在TheJournalofClinicalInvestigation上撰文，表明在肥胖个体的空肠隐窝中用苦味化合物会诱导抗菌肽和蛋白质的释放，这些肽和蛋白质(CLCA1)决定粘液的结构排列，从而影响大肠杆菌的生长。长时间与苦味化合物孵育影响免疫因子(防御素，黏蛋白，趋化因子)的mRNA表达，并通过调节GDF15、ADM2和LDLR的表达来影响食物摄入和甘油三酯代谢的途径。
研究者发现，通过肥胖患者的空肠隐窝培养物的双免疫荧光染色发现苦味受体TAS2R43与α-防御素5+细胞(Paneth细胞的标记物)和黏蛋白2+细胞(杯状细胞的标记物)共定位。对TAS2R10的共定位研究显示与α-防御素5+共定位。然而，研究者发现一些TAS2R10+细胞与杯状细胞非常接近，这表明杯状细胞可能被TAS2R10激动剂间接刺激。
图1.肥胖患者原发性隐窝中TAS2R43和TAS2R10与Paneth或杯状细胞共定位。
苯甲酸地那铵是已知的最苦的化合物。研究者测量了细胞内Ca2+水平对苯甲酸地那铵暴露的反应，发现苯甲酸地那铵处理后Ca2+反应性发生改变，其中高剂量作用后可增加其Ca2+反应性，且苯甲酸地那铵和KCL处理后荧光强度上升。为了确定苯甲酸地那铵是否诱导了Paneth细胞或杯状细胞中的Ca2+变化，免疫染色发现α-防御素5免疫反应细胞对高剂量苯甲酸地那铵反应，对低剂量苯甲酸地那铵反应增加。而黏蛋白2免疫反应细胞的Ca2+反应减少。因此，苦味化合物苯甲酸地那铵改变了肥胖个体空肠隐窝的细胞内Ca2+水平。
图2.肥胖患者原发性隐窝细胞内Ca2+变化对DB的响应和免疫染色鉴定。
研究者通过在隐窝免疫染色图像中定量Paneth细胞标记物来评估苯甲酸地那铵对Paneth细胞抗菌肽释放的影响，发现用阳性对照卡巴荷处理肥胖个体的空肠隐窝30分钟，α-防御素5和6及溶菌酶的中位荧光强度均降低，从而诱导这些蛋白质的释放。而在1mM苯甲酸地那铵处理30分钟后，α-防御素5和溶菌酶表达降低，但α-防御素6的表达未降低。与此同时，发现苯甲酸地那铵对瘦的受试者隐窝中这些抗菌肽的释放没有影响，且苯甲酸地那铵对肥胖个体空肠隐窝中α-防御素5释放的影响是急性效应，在刺激2或4小时后未观察到，且苯甲酸地那铵对α-防御素6蛋白表达无时间依赖性影响。因此，苯甲酸地那铵在肥胖个体隐窝中诱导α-防御素5和溶菌酶的急性释放，但在瘦个体中没有。
图3.定量分析DB对瘦和肥胖个体Paneth细胞蛋白表达的时间依赖效应。
先前研究发现苦味化合物苯甲酸地那铵本身具有直接抑菌作用，为了找到没有抑菌作用的苦味化合物，研究者测试了其他几种合成的和天然的苦味化合物，以及苦味细菌群体感应分子，这些分子可以激活肠道中表达良好的TAS2Rs。1mM苯甲酸地那铵、25μMC12-O-AHL和TAS2R10激动剂cucurbitacinE(CuE,0.1μM)抑菌作用显著，奎宁-CSN刺激大肠杆菌的生长，其他则无直接或间接影响。Westernblot分析显示，苯甲酸地那铵(1mM)和CuE(0.1M)显著降低肥胖患者隐窝裂解液中α-防御素5的表达，而C12O-AHL(25M)和芦荟素Aloin则无显著影响。再生胰岛衍生蛋白3α(REG3A)的蛋白表达仅在苯甲酸地那铵(1mM)时降低。研究发现芦荟素促进TAS2R43+患者中大肠杆菌生长，但在TAS2R43-患者中没有。色氨酸位于TAS2R43第35位(TAS2R43+W)的个体对芦荟素的苦味非常敏感，而丝氨酸位于35位(TAS2R43+S)的个体对芦荟素不太敏感。TAS2R43+W肥胖患者的样本中Aloin-CSN显著促进大肠杆菌的生长。这些发现表明，与口腔和肠道相似，TAS2R43对芦荟素的敏感性由其基因型改变。
图4.苦味化合物刺激及TAS2R43对肥胖患者CSNs中大肠杆菌生长的影响。
为了确定芦荟素Aloin-CSN如何在CFU实验中增加大肠杆菌的生长，研究者对芦荟素刺激肥胖患者空肠隐窝上清进行蛋白质组学分析，发现30μM芦荟素(Aloin-CSN)刺激后所有上清样品的数据集未观察到分泌蛋白的显著差异。但是仅对CFU实验中刺激细菌生长的样本和来自TAS2R43+患者的样本进行分析，发现钙激活氯通道调节因子1(CLCA1)和钙调蛋白1-3(CaM1-3)在芦荟素处理后显著增加。黏蛋白2经芦荟素处理后无明显升高，但黏液蛋白CLCA1和黏蛋白2的log2FC正相关。
图5.根据TAS2R43基因型和CFU测定对大肠杆菌生长的影响，对芦荟素刺激肥胖患者空肠隐窝上清进行蛋白质组学分析。
研究者发现空肠中α-防御素(DEFA5,DEFA6)、β-防御素(DEFB1,DEFB4A)和黏蛋白(MUC1,MUC2)的基础mRNA表达在瘦和肥胖个体之间没有差异。在肥胖个体的空肠隐窝中DB以浓度依赖的方式降低了DEFA5、DEFA6的mRNA表达，但对DEFB1、DEFB4A的mRNA表达影响较小，不影响MUC1或MUC2的表达。TAS2R激动剂DB使TAS2R43+个体隐窝中DEFA6mRNA表达显著降低，而TAS2R43-肥胖个体隐窝中DEFA6mRNA表达降低幅度较小，肥胖患者TAS2R43+和TAS2R43-隐窝中DB诱导的DEFA5mRNA表达下降的幅度没有差异。
图6.瘦和肥胖个体隐窝中防御素和黏蛋白mRNA表达的变化对DB的响应。
研究者对样本进行了转录组分析，发现与对照组(DMEM处理)相比，肥胖患者隐窝的1mMDB治疗与TAS2R43基因型无关，调控基因为生长分化因子15(GDF15)；氨基酸转运蛋白SLC38A2和线粒体编码转移RNA蛋氨酸(MT-TM)。此外，在粘蛋白中仅MUC17的表达增加。DEFA5、DEFA、粘液蛋白编码基因CLCA1等均因DB处理而下调，其中观察到趋化因子CCL3和CCL4的下降最为明显。通过IPA(IngenuityPathwayAnalysis)分析发现，这两种分子以及CCL2的下调与IL-17A和IL-17F对肠上皮细胞因子产生的差异调控有关。此外，1mMDB处理激活了NRF2介导的氧化应激反应、未折叠蛋白反应、ILK、AMPK、p38MAPK和磷脂酶C信号通路，而抑制了整合素和EIF2信号通路。研究者通过qPCR验证了转录组数据，结果显示DB以浓度依赖的方式增加了GDF15的表达。GDF15与肾上腺髓质素2(ADM2)和LDL受体(LDLR)强相关。综上所述，这些研究结果表明，在肥胖患者的空肠隐窝中，DB改变了免疫因子(抗菌肽、黏蛋白、细胞因子)的表达，并诱导轻度应激反应，导致控制食物摄入的mitokine基因(GDF15,ADM2)和脂蛋白稳态(LDLR)上调。结果表明GDF15是表达最显著的DEG。TAS2R43+肥胖患者使用TAS2R43激动剂芦荟素处理空肠隐巢(4h)，鉴定出10个DEGs，而TAS2R43-患者中未鉴定出DEGs，这些发现表明TAS2R43参与了这些基因的调控。火山图显示MT-ATP6最为显著，与其他显著上调的线粒体基因一起属于氧化磷酸化通路。ANXA2是BAG2信号通路的一部分，也参与分泌囊泡胞吐。两个下调的基因，ZFR和PABPC1参与RNA结合，因此参与蛋白质的翻译。DB处理改变了免疫因子和代谢调节因子的mRNA表达。
图7.DB或芦荟素刺激肥胖患者空肠隐窝的转录组学分析。
总之，实验表明苦味化合物可以激活肥胖患者肠隐窝中的途径，从而引发影响大肠杆菌生长的防御机制，改变了几种抗菌肽、粘液蛋白和细胞因子(CCL2-4)的mRNA表达。确定TAS2R10是改变人肠道抗菌肽释放的潜在靶点。此外，芦荟素诱导CLCA1释放，激活氧化磷酸化，并以TAS2R43依赖的方式影响囊泡运输和蛋白质翻译相关基因的mRNA表达。此外，苯甲酸地那铵诱导NRF2介导的应激反应和未折叠蛋白反应，导致表达增加控制厌食信号和脂蛋白稳态的核分裂因子GDF15和ADM2和LDLR基因的改变。
总之：这种最苦的药能改变肥胖人群的免疫反应。胖子要多吃苦！
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