最近，上海交通大学朱家全/崔文国教授团队通过多功能微环境保护的外泌体-水凝胶。这种外泌体水凝胶是通过Ag+-S动态配位并与脂肪干细胞衍生的外泌体（ADSC-exo）融合而配制的，产生的注射剂足以减轻感染风险，同时还具有ADSC的抗原成分和旁分泌信号传导活性源细胞。在体外，这种外泌体水凝胶发挥出色的新血管生成促进作用，增加人脐静脉内皮细胞的增殖和管形成，分别为1.87和2.2倍。在体内，微环境保护的外来体水凝胶还显示出促进新血管形成和组织再生，同时抑制局部组织纤维化。相关论文以题为MicroenvironmentProtectedExosomeHydrogelforFacilitatingEndometrialRegeneration,FertilityRestoration,andLiveBirthofOffspring发表在《Small》上。
在这项研究中，通过Ag-S配位配伍通过将4-臂SH-PEG与Ag+交联而使ADSCs-exo负载的可注射水凝胶具有抗感染和微环境保护特性。ADSC衍生的外泌体包含与血管生成和受损的组织再生相关的关键因素，先前的研究表明它们可以抑制细胞凋亡并增强体内再生。如预期的那样，通过Ag-S配位生成的动态PEG水凝胶具有出色的可注射，自修复，可降解和抗菌特性（图1）。
图1ADSC-exo水凝胶的开发示意图。水凝胶是通过四臂PEG-SH的Ag-S配位和ADSC外泌体的负载制备的。将由此产生的ADSCs-exo水凝胶，在其中介导ADSC-exosome和Ag+的持续释放，促进新血管形成，并发挥抗感染和抗纤维化的作用。
2.1ADSC衍生的外泌体特性和活性的表征
首先从腹股沟脂肪组织样本中分离ADSC。分离的细胞迅速扩增并表现出纺锤形，成纤维细胞样的生长模式（图2A）。免疫荧光染色显示，这些细胞中有90％以上对ECM标志物纤连蛋白和层粘连蛋白以及SOX2多能性标志物呈阳性。这些ADSC的流式细胞仪分析显示，它们对干细胞标记CD90（99.7％±4.3％），CD（95.8％±4.7％）和CD44（98％±5.3％）呈阳性（图2B）。CD11b，CD31，CD34，CD83，CD和MHC-II均为阴性（数据未显示）。然后使用差异离心法分离衍生自这些ADSC的外泌体，随后通过SEM，Western印迹，流式细胞仪和TRPS分析对这些外泌体进行表征。TRPS测量显示这些ADSC来源的外泌体大小为50–nm（图2C），而SEM则显示它们呈杯状或圆形外观，大小为50–nm（图2D），与TRP结果。流式细胞仪证实这些外泌体是高纯度的，并且对外泌体表面标记CD63和CD9呈阳性（图2E），并且Western印迹法同样显示出高水平的外泌体CD9和CD63表达（图2F）。这些数据一起表明已经成功制备了ADSC衍生的外来体。还建立了外泌体释放曲线（图2G，H），并证明这些生物活性外泌体有效地封装在PEG水凝胶中，该凝胶促进了14天以上ADSC外泌体的持续释放，在此期间95％的这些外泌体被释放。
图2ADSC和ADSC衍生的外来体表征。A）对ADSC进行免疫荧光染色，发现ECM标记纤连蛋白和层粘连蛋白以及多能性标记Sox2（比例尺：50m）的阳性率均90％。B）通过流式细胞仪分析ADSC，发现它们对CD90，CD和CD44呈阳性，对CD11b，CD31，CD34，CD83，CD和MHC-II呈阴性。相应的同型对照抗体也产生了阴性染色结果。C）ADSC-exo粒度值。D）ADSC-外泌体的SEM图像（比例尺：nm）。E）通过流式细胞仪评估对CD63和CD9的ADSC-exo阳性。F）通过Western印迹评估CD63和CD9的ADSC-exo阳性。G）在14天的时间内从PEG-Ag水凝胶中累积释放ADSC-exo。H）PEG-Ag水凝胶的每日ADSC-exo释放曲线。
2.2ADSCs-满载Exo的PEG水凝胶的特性
在本研究中开发的PEG-Ag水凝胶如图3A所示。简而言之，四臂PEG通过Ag-S配位与Ag+交联，生成可注射的PEG-Ag，可以将其与ADSC-外来体一起装载。制备的PEG-硫醇溶液表现出优异的流动性（图3B），因此，假设这些水凝胶在注射后能够自我修复。通过SEM对水凝胶表面进行了评估（图3C），发现已掺入和未掺入ADSC-外泌体的水凝胶之间无显着差异，表明ADSC-外泌体与PEG水凝胶成功结合。作者还证实了这些制备的水凝胶适合注射，并且能够在去离子水（DI）溶液中保持其形状（图3D）。在PBS溶液中，外泌体水凝胶可以在4天之内保持一定的质量，因为从第四天开始，外泌体水凝胶的降解速度加快了，并且只有10％的质量在10天后仍未充分降解（图3E）。这种降解行为为体内ADSCs外泌体提供了稳定的结构，以促进受损子宫内膜的组织再生并调节局部微环境。然后，评估了制备的ADSC-exo水凝胶耐受外部应变的能力。损耗模量（G”）能够承受约60％的应变增加，而弹性模量（G）则持续下降（图3F，G）。流变仪还用于评估可回收性，表明在施加高剪切速率之前，ADSC-exo水凝胶能够保持胶体状态，同时保持≈7.5×Pa的粘度。在高剪切速率下，该水凝胶的结构被破坏，粘度降至≈0.7×Pas。然而，在高剪切速率去除的几秒钟内，水凝胶恢复到类似于施加剪切力之前的状态（图3H）。经过两步的应变循环，这些PEG水凝胶的G明显降低，而制得的ADSC-exo水凝胶的G仅显示微不足道的变化（图3I）。
图3ADSCs水凝胶表征。A）自愈和注射机制。B）四臂PEG-硫醇，AgNO3和脂肪干细胞衍生的外泌体的混合物。C）水凝胶和ADSCs-水凝胶制剂的SEM图像。D）注入蒸馏水后的水凝胶图像。E）水凝胶和ADSCs-水凝胶的体外降解曲线。F）PEG-Ag水凝胶的储能模量的应变扫描测量值（G和G”分别对应于弹性模量和损耗模量），单位为kPa。G）ADSCs-exo
水凝胶的储能模量的应变扫描测量。H）测得的粘度参数与时间之间的关系，以秒为单位。测得的应变剪切率在s的0.05％和50s的％之间。I）在两次0％阶跃应变的循环之后，各种水凝胶的G’回收率。J）Ag离子从水凝胶和ADSCs-水凝胶中的释放行为。K）ADSCs-exo水凝胶的体外细胞毒性和第1、3和5天的活细胞定量分析。2.3ADSC-Exo和HUVEC生物相容性的体外评估
血管生成是内皮细胞增殖，迁移和管形成产生可支持组织修复的新血管的过程。在此，这种基于3天的治疗后免疫荧光Ki67染色评估了制备的ADSC-exo水凝胶在体外影响HUVEC增殖的能力。该分析表明，ADSC-exo水凝胶和ADSC-exo治疗组中的大多数细胞均显示Ki67阳性，而在其他治疗组中检测到的Ki67阳性细胞却很少（图4A），而ADSC-中的Ki67阳性率最高。exo水凝胶组相对于其他治疗组（图4B）。
图4游离ADSC外泌体或AgNO3+ADSC外泌体对HUVEC增殖，迁移和管形成的影响。A）使用免疫荧光染色检测Ki67，作为指示的治疗组中HUVEC增殖的量度（比例尺：50μm）。B）量化指定组的Ki67阳性细胞数量。C）对所示治疗组中的HUVEC进行Transwell迁移分析（比例尺：μm）。D）定量Transwell分析中迁移的HUVEC的数量，显示在ADSC-exo或AgNO3+ADSC-exo处理后迁移增强。E）将指定治疗组中的HUVEC细胞用于体外管形成测定。F）量化每个视野中的试管数量，揭示了ADSC-exo或AgNO3+ADSC-exo处理后HUVEC试管形成的改善。
参考文献：
doi.org/10.2/smll.207235
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