干货分享中我们全面介绍了Cas系统，小伙伴们已经对CRISPR/Cas9系统的基础原理进行了初步掌握，而基因敲除作为CRISPR/Cas9技术最为广泛的应用，相信大家对于具体怎样实现基因敲除会感到十分好奇，今天就来带大家系统的了解一下CRISPR/Cas9系统在基因敲除方向的应用，本篇干货主要介绍内容包括基因敲除原理、敲除单克隆细胞株的构建、基因片段敲除和敲除实用案例分析。
一、CRIPSR/Cas9实现基因敲除的原理
CRISPR/Cas9系统是利用一段与靶序列互补的gRNA引导cas9核酸酶对特异靶向的DNA进行识别和切割，造成双链DNA断裂，然后细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源末端连接（Non-homologousendjoining,NHEJ）或同源介导的修复（Homology-directedrepair,HDR），而基因敲除则利用的是NHEJ的修复方式，在Cas9切割诱导DNA双链的断裂后，细胞启动NHEJ修复机制，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，如果插入或缺失3的非整数倍个的碱基，则会造成基因的移码突变，从而使靶基因无法编码正确的蛋白质，以此实现基因敲除效果，当然这是针对编码基因而言，对于非编码RNA的基因敲除或特定区域片段的删除，则需要在目的片段的两端分别设计一条gRNA，通过共转两条gRNA引导Cas9到指定位置切割达到删除目的片段的效果。
图1.CRISPR/Cas9介导的基因编辑示意图
二、敲除单克隆细胞株的构建
1.确定基因，选择合适的细胞系
根据研究内容确定待敲除的目的基因和细胞系。敲除前应首先通过网站查找预测、文献查阅等明确待敲除基因的功能并评估敲除此基因是否致死；在细胞系的选择上，优先选择容易转染且单克隆增殖能力较强的细胞。
2.gRNA的设计与合成
一般来说，基因特异的gRNA模板序列为位于PAM序列的前20nt。常用spCas9蛋白识别的PAM序列特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此，gRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，我们也可根据序列自行设计。针对于gRNA序列的设计有很多网站可以参考，通过网站评分综合选择就好。这里小恒推荐两个较权威的网站：
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