生物制药巨头Amgen作为最早采用BerkeleyLights技术的用户之一，将Beacon平台的使用范围从抗体发现扩展到细胞株开发。Amgen团队也第一个发表了基于Beacon平台的细胞株单克隆性的论文，验证了Beacon系统可以99％的单克隆保证率产生单克隆。[1][2]
GSK公司的细胞株开发部门淘汰了其原有的流式细胞分选系统（FACS），将其换为Beacon单细胞光导平台。基于Beacon平台，该团队针对一个先导药物分子可以筛选1,至4,个克隆，整体筛选容量较传统方法提高5–15倍。[3]
美国知名生物制药和CDMO企业CatalentBiologics利用其专有的GPEx?CellLineDevelopment技术为最难表达的蛋白创造稳定、高产的哺乳动物细胞系，当与Beacon平台结合后细胞系筛选时间相比于利用ClonePix等传统技术缩短两个半月以上，尤其针对低表达的抗体产物，利用Beacon所筛到的克隆滴度较传统平台提高了3倍。[4]
台湾地区生物制药先驱企业MycenaxBiotech也已经于今年9月引进Beacon系统，成为台湾地区第一家采用BerkeleyLights技术的公司。Mycenax从许多不同的细胞类型开发高质量的细胞株，并将利用Opto?CLDWorkflow将所有细胞株开发过程转移至Beacon平台以发现具有行业领先单克隆性的稀有高产率克隆，同时将其细胞株开发的总体时间缩短50％以上。[5]
作为细胞株开发的创新平台，BerkeleyLights的Beacon平台可以在短短一周之内筛选出99％单克隆保证率的高产细胞株。强大的影像记录以及数据分析能力记录了每个克隆的丰富特征图谱（Titer/Qp/Doublingtime等），不仅有助于快速筛选稳定高产的细胞株，而且在对于最优克隆的选择以及后期生物反应器的放大培养提供了非常有价值的参考数据。
抗体药物开发通常耗时漫长，涉及很多步骤，包括靶点选择与验证、先导抗体的发现、抗体优化、临床前药学开发、CMC及临床试验等。其中，作为整个药物CMC的起点，细胞株开发是极为关键的环节，后续的CMC工艺开发、临床前和临床试验全都是基于确定的细胞株进行开展的。细胞株开发的速度、合规性影响到药物开发的进度和最终成败，细胞株产量影响到后续工艺放大的效率及最终生产成本，细胞株质量则影响到药物的安全性和有效性。
细胞株开发涉及的工作流程包括：宿主细胞的选择、表达载体的构建、转染方法、单克隆筛选技术、细胞培养工艺等，而其中单克隆细胞的筛选最为关键。通常筛选的标准包括：滴度水平（Titer）及单位时间单个细胞所表达的抗体量（Qp）、生长状态、倍增时间（Doublingtime）、稳定性（遗传、代谢）等。
目前常见的单细胞分离和筛选方法包括：有限稀释法（Limitingdilution）、流式细胞分选（FACS）、单细胞打印（Singlecellprinting）、ClonePix、及VIPS(Verifiedin-situplateseeding)等。但这些方法存在各自的局限性，使得整个单克隆筛选成为CLD过程中最为耗时耗力的一个环节。问题主要包括：
首先，单细胞分离的效率低下。每种方法在执行时均存在不同程度的误差，必须在后期通过额外的成像手段追踪来验证单克隆性从而保证合规性。
第二，分离后单细胞在微培养板中生长状况不良。由于细胞间信号传导的丢失，以及微孔板体系中细胞自分泌因子和旁分泌因子的稀释，细胞需要时间来恢复状态才能进行扩增。
最后，缺乏能够在单细胞水平进行抗体分泌检测从而进行高通量筛选的方法，上述所有方法都需要将克隆扩大培养到一定细胞数量才能进行蛋白分析以及滴度和质量的筛选，不可避免地延缓了开发进度，同时对扩大培养的依赖则严重限制了能够同时进行筛选的单克隆的通量，导致很容易丢失掉比例稀少的高滴度高质量的单克隆。
图1.Beacon平台可以在短短一周内筛选出99％单克隆保证率的高产细胞株
作为细胞株开发的创新平台，BerkeleyLights的Beacon平台可以在短短一周之内筛选出99％单克隆保证率的高产细胞株。强大的影像记录以及数据分析能力记录了每个克隆的丰富特征图谱（Titer/Qp/Doublingtime等），不仅有助于快速筛选稳定高产的细胞株，而且在对于最优克隆的选择以及后期生物反应器的放大培养提供了非常有价值的参考数据。(图1)
Beacon平台上最新推出的OptoCLD2.0Workflow将功能进一步拓展:
（1）可针对稀有细胞群进行特异性富集；
（2）针对非传统结构的抗体分子也可在芯片上进行在线滴度检测；
（3）对最优克隆进行更高效的回收便于工艺放大。
Beacon平台OptoCLD2.0Workflow概述
Beacon平台的OptoCLD2.0Workflow用全部自动化的工作流程取代了传统方法中非常耗时且极易出错的孔板操作步骤，在不到3小时即可将单细胞从转染库（transfectedpools）克隆到OptoSelectTM芯片上的数千个纳升级的NanoPenTM小室中；并能够自动检测和自动移除多细胞并重新导入，从而确保每个NanoPen有且仅有1个细胞。(图2)
图2.在单细胞导入阶段，OEP技术可自动移除多细胞，确保每个NanoPen小室仅有1个细胞，
在克隆步骤中使用TargetPenandSelection（TPS）加载功能则可以选择性地富集具有特定表型（如细胞大小、活力、表面标志物表达）的细胞。在体积微小的NanoPen小室中可对细胞进行多天高效的在线（on-chip）生长，以及对分泌的抗体分子进行定量滴度检测。利用SpotLightTMHumanFc和SpotLightTMHumanκ荧光试剂在数天内进行多次定量滴度检测，从而能够检测传统抗体和非传统抗体分子，如Fc端改造的单抗以及双特异性/多特异性抗体分子。(图3)
图3.OptoCLD2.0Workflow
每个克隆全流程的完整图像均可在软件中进行跟踪，并且可以基于多个参数，如生长速率、分泌滴度和细胞相对生产力（rQp）来选择克隆用于回收。通过使用标准的细胞导出方法（OEPUnpen）或新的细胞导出方法（OEP+BubbleDislodgeUnpen）方法，能够以超过99%的单克隆保证率对克隆进行回收，确保能够有效且高产率地对最优克隆进行回收用于下游工艺放大。
1.富集特定表型的单细胞
用户可灵活定义逻辑门，利用TPS目的性选择具有特定特征的细胞，这些特征包括细胞大小、活力和/或表面标志物表达，能够通过明场和荧光成像的组合进行检测。通过使用如CellTrackerGreen和AnnexinV等标志物，TPS可以分别用于富集活细胞或排除凋亡细胞。(图4)
图4.TPS功能能够从用AnnexinV染色的活细胞和非活细胞混合物中富集超过97%的活细胞。
基于细胞活力的TPS操作通过排除死细胞提高了有效筛选通量。这种对活性克隆预富集的能力使得用户能够在转染后的早期阶段就对细胞库进行筛选，从而覆盖更高的单克隆多样性。
2.在线培养（On-chipculture）
通过芯片通道灌注培养液，可以在OptoSelect芯片上对克隆后的细胞进行培养。细胞驻留在NanoPen小室中，新鲜培养液扩散到NanoPen中，废物扩散到NanoPen外。通过精确控制细胞培养条件使得克隆能够以高活力进行在线扩增。细胞的在线培养可长达5天之久，用户可以在多代细胞之间检测生长和倍增时间。On-chip的整个工作流程中克隆都会被进行图像记录，从而提供良好的数据资料，可用来轻松地对单克隆性进行图像化确认。(图5)
图5.细胞可在OptoSelectTM芯片上培养5天以上。
A.精确控制培养条件能够实现细胞的高效克隆，12批四芯片的OptoCLD2.0Workflow实现了平均70%的克隆扩增（从超过个克隆中）。Y轴在线克隆扩增（On-chipclonalexpansion）的定义为，在芯片上培养4天后扩增为超过6个细胞的克隆的单个细胞的比例。
B.从空的NanoPen小室、单细胞克隆化到多天的在线培养，on-chip的整个工作流程中克隆都会被进行图像记录。这些图像记录作为良好的数据资料可非常方便地对单克隆性进行图像化确认。
3.利用特定检测方法选择产生复杂抗体分子的最优克隆
传统方法由于缺乏用于检测复杂抗体分子的合适试剂而限制了对高质量细胞系的选择。常规的抗体捕获试剂通常结合在抗体Fc区；然而对于现在层出不穷的复杂结构的抗体分子（如双特异性和多特异性抗体），Fc端通常是经过工程化改造的，导致传统检测试剂受到Fc修饰影响而无法与抗体进行很好地结合。（图6）
图6.传统抗体分子与非传统抗体分子
OptoCLD2.0Workflow使得用户能够使用SpotLightHumanFc和SpotLightHumanκ试剂分别对抗体的Fc或κ轻链的结合进行定量检测。（图7A）SpotLight实验对数千个克隆的分泌滴度和比生产率（rQp）定量，并且在线培养的数天内可以进行多次检测。相比于传统克隆挑取技术，当进行工艺放大至摇瓶进行分批补料培养（fed-batch）之后，SpotLightHumanFc实验所挑选和回收克隆的滴度高1.5到3倍[4]。SpotLightHumanκ实验可用于检测含有Fc突变的传统抗体和非传统抗体分子。SpotLightHumanFc与SpotLightHumanκ实验两个Assay的得分呈高度相关（R2=0.88）（图7B和C）。
图7.利用SpotLight实验进行在线定量滴度检测。
A.SpotLightHumanFc试剂与人抗体分子的Fc区域结合，而SpotLightHumanκ试剂与人抗体的κ轻链结合。
B.SpotLightHumanFc和κ实验可以在同一个克隆上运行。
C.SpotLightHumanFc和κ实验使用分泌传统抗体的细胞系进行，该抗体具有等比例的重链和κ轻链。90%以上最优克隆通过SpotLightHumanκ和SpotLightHumanFc两种实验均可进行鉴定，验证了两种方法的准确性。
对SpotLightHumanFc和κ检测实验进行组合扩大了可检测的抗体分子的多样性，包括传统IgG、突变IgG和双特异性抗体，使用OptoCLD2.0Workflow可筛选所述各类抗体分子的细胞系。（表1）
表1.SpotLightHumanFc和κ检测实验的组合扩大了可用以筛选细胞系的抗体分子的多样性。
SpotLightHumanFc和SpotLightHumanκ检测实验在8种分泌不同复杂抗体分子的细胞系上进行了测试，这些抗体分子类型包括未修饰的IgG1抗体、Fc改造的IgG1抗体和双特异性抗体。SpotLightHumanκ检测实验能够实现对分子3和7的细胞系的分泌滴度的在线检测，而这样的检测无法用Fc结合试剂实现。分子6用作阴性对照。数据来自于GSK。
4.以＞99%的单克隆保证率导出最优克隆
在芯片上对单克隆进行培养和检测后，将克隆以＞99%的单克隆保证率回收到96孔板中，用于随后的工艺放大。
OptoCLD2.0Workflow为克隆回收提供了两个选项，标准的OEPUnpen方法和新的OEP+BubbleDislodgeUnpen方法。标准的OEPUnpen方法利用光将克隆从NanoPen小室移动到芯片主通道中，然后将克隆在培养液中导出到孔板。
在某些情况下从NanoPen小室回收克隆需要使用更大的力道，为了使所选克隆的回收率最大化，OEP+BubbleDislodgeUnpen方法基于所选克隆对光操作的响应情况对细胞导出过程进行动态调节。通过将基于光和基于气泡的操作与动态算法相组合，OEP+BubbleDislodgeUnpen方法以高的释放效率从每个克隆中回收更大量的细胞（图8A和表2）。从每个Nanopen小室中回收细胞数量的增加使得导出克隆的生长效率更高（图8B）。通过OEP+BubbleDislodge方法导出输出的克隆达到汇合的速度也快于使用OEPUnpen方法导出的克隆（图8C）。OEPUnpen和OEP+BubbleDislodgeUnpen两种方法都可以在每次克隆导出后通过彻底冲洗液路而实现超过99%的单克隆保证率（表2）。
图8.使用OEP+BubbleDislodge方法高效回收最优克隆。
A.OEP+BubbleDislodgeUnpen从每个Nanopen小室中回收的细胞数量高于标准OEPUnpen方法，平均从每个克隆中导出19个细胞。
B.从每个Nanopen小室回收更多的细胞使得导出克隆的生长效率更高。当每个克隆有超过30个细胞导出时，回收到孔板的克隆实现扩增的比例达到%。
C.含有使用OEP+BubbleDislodgeUnpen方法导出的克隆在孔板里生长的汇合速度快于用OEPUnpen方法回收的克隆。
表2.OEPUnpen与OEP+BubbleDislodgeUnpen方法的比较。
两种细胞释放方法都能以99%的单克隆保证率对克隆进行回收。与OEPUnpen相比，OEP+BubbleDislodgeUnpen的释放效率更高，克隆生长更高，并且整体产率更高。释放效率（unloadingefficiency）定义为在克隆导出过程中从Nanopen小室中成功移出的目标克隆的百分比。导出克隆的生长效率（ExportedCloneOutgrowthEfficiency）定义为回收到孔板中的克隆实现扩增的百分比。整体产率（Overallyield）是由单克隆比例、释放效率和导出克隆的生长效率计算而得。
结语
基于OptoCLD的工作流程，Beacon平台在短短一周内就能以超过99%的单克隆保证率对产生复杂抗体分子的最优分泌细胞系进行筛选。
使用TPS实现稀有单细胞的富集和精准的单克隆化、长时间全程记录的在线培养、可检测非传统结构抗体的在线检测实验、利用高效导出方法实现最优分泌克隆的高产率及快速工艺放大，基于上述这些方式，Beacon平台大大加快了细胞株开发的进程，非常适用于下一代抗体疗法的快速开发。
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Reference
1.