一、思想准备:
培养NK92细胞之前必须有充足的思想准备,这株细胞非常不好养,而且不能偷懒,必须勤快。细胞对氧气、密度和养分非常敏感,稍微偷懒拖一天不换液,可能就会导致细胞全部死亡的后果。只要保持换液和传代频率,多注意细胞密度,这株细胞还是可以征服的!
二、细胞形态特点:
细胞偏圆或偏椭圆,透亮,成团生长。只有成团的细胞有增殖活性,单个的细胞基本没有增殖活力。细胞团可生长成肉眼可见的大团块。死了的细胞会皱缩,不再透亮而变得灰暗。细胞对氧气、养分及细胞密度非常敏感。养分不够或密度太高情况下,细胞很容易凋亡。
NK92:XNK92:X三、细胞培养技巧:
细胞刚复苏或密度较低时可以把培养瓶立起来培养,以提高细胞密度,促进细胞聚团。当细胞聚团正常生长后,建议平躺着培养该细胞,以增大空气交换面积,且液体高度最好不要超过3mm,一般T25培养瓶加6-8mL培养基,T75培养瓶加15mL左右培养基即可。培养基尽量现配,配好的培养基最好两周内用完,因为叶酸和IL-2不稳定易分解。
一般情况下细胞2-3天换液一次,即使培养基没有变*。换液时轻轻侧过培养瓶/皿,不要使细胞飘起来,用巴氏吸管轻轻吸取部分上清弃去,补加等体积的新鲜培养基继续培养。或者将全部培养液转移至离心管中,0rpm,离心5min,吸去上清后用新鲜培养轻轻重悬后重新种瓶,重悬时不可吹打过度。细胞对离心和吹打比较敏感,离心和反复吹打会影响细胞状态,建议只在细胞产生大量碎片时才离心清洗。平常换液建议半换,传代可直接补加足够新鲜的培养基后直接分瓶。
细胞团长至肉眼可见,且T25瓶子有几十上百个小团时,细胞数量已经比较多,此时应该2天换液一次。当一个20倍视野有4-5个大细胞团时应该进行传代。传代时加入两倍体积的新鲜培养基后,轻轻吹打细胞团,将大的细胞团打散成小团,但不要剧烈吹打成单细胞悬液,因为单个的细胞是基本没有增殖活力的细胞,然后将混匀的细胞悬液转移至新的培养瓶中。或者将细胞悬液转移至离心管中,0rpm离心5min后,弃去上清,加入三倍体积的新鲜培养基轻轻重悬后转移至三个新的培养瓶中。
NK-92冻存液用50%血清+40%完全培养基+10%DMSO,NK92/MI的冻存液则使用90%血清+10%DMSO。细胞数量应在0.5-1.0×/mL为宜。复苏时可适当加大胎牛血清的含量,以使细胞尽快长起来。复苏后细胞需要重新聚团及较长的潜伏期,故复苏时间较长,期间应多加观察,并注意更换培养基,频率为3天一换(半换)。