1、哺乳动物常规表达载体
2、哺乳动物慢病*表达载体
3、哺乳动物腺病*表达载体
4、哺乳动物腺相关病*表达载体
5、哺乳动物piggyBac表达载体
6、SleepingBeauty转座载体
1、哺乳动物常规表达载体：
概述：在生物医学领域，利用常规转染将质粒载体转到哺乳动物细胞中是使用最广泛的方法。虽然近年来开发了不少更为先进的基因导入载体系统（如慢病*载体、腺病*载体、AAV载体和piggyBac等），但常规质粒基因表达载体仍被大多数实验室使用，这主要得益于其在技术上的简便性以及在各种类型细胞中的高效转染率。常规质粒载体转染的关键特点是短暂性，并且在宿主基因组中的整合效率非常低（通常小于1%）。
优势
技术简单：常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病*载体需要进行病*包装，过程更简单。
载体容量非常大：与慢病*，腺病*、腺相关病*相比。常规载体载体总容量可达30kb，其中质粒骨架只占3kb，有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。
高水平表达：常规质粒转染细胞后，可以产生非常高的拷贝数（每个细胞多达几千拷贝），使外源基因能高水平表达。
不足之处
载体DNA非整合型：常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在，所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而，质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中（质粒转染每~个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合，整合效率取决于细胞类型）。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中，在经过扩大和传代培养后，可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。
可转染的细胞类型受限：不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染局限于体外细胞实验，很少运用到活体实验。
基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性：尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数，但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中，质粒拷贝数非常高，而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病*转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。
质粒图谱及组成元件：以过表达hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
2、哺乳动物慢病*表达载体
概述：慢病*载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。除了常规质粒转染外，目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点，使得慢病*载体系统成为倍受欢迎的外源基因表达系统。
慢病*载体来源于人类免疫缺陷病*HIV，属于逆转录病*家族。野生型慢病*基因组是线性双正链RNA。
慢病*重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个长末端重复序列（LTR）之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病*蛋白将其包装形成病*颗粒。包装后的活体病*将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病*转染靶细胞。
当病*转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病*RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病*载体中，位于两个LTR的DNA片段和病*基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。
慢病*载体删除了与病*包装和转导相关的基因（这些基因由辅助质粒进行表达，用于病*包装过程），使产生的慢病*颗粒是复制缺陷型的。即包装的病*只具有转导靶细胞的能力，而无法在靶细胞中进行大量复制，因而具有很高的生物安全性。
优势
外源基因的稳定整合：常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反的是，慢病*转导的目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中，因而会随着宿主细胞的分裂而稳定遗传。
滴度高：病*载体可以包装出高滴度的病*。病*包装服务，病*滴度可以达到10TU/ml。在这样的病*滴度下，如果选择合适的剂量去转导体外培养的哺乳动物细胞，则转导效率可接近%。
宿主范围广泛：病*包装系统包装出来的病*含有VSV-G包膜蛋白，此蛋白拥有非常广泛的亲和性，可以转导几乎所有的哺乳动物细胞，包括分裂细胞，非分裂细胞，原代细胞，稳定细胞系，干细胞，分化细胞，贴壁细胞和悬浮细胞等各类哺乳动物细胞，甚至还可以转导一些非哺乳动物细胞。使用传统的转染方式转导神经元细胞是非常难的，但是采用慢病*载体系统可以轻易的实现神经元细胞的转导。相对于在某些细胞中具有较低转导效率的腺病*和不能用于非分裂细胞的逆转录病*而言，利用慢病*包装系统包装出来的病*具有广泛的亲和性。
灵活使用启动子：市面上常见的慢病*载体已经过优化，其5LTR的启动子已进行了自失活。因此，客户可以灵活使用启动子来驱动目的基因的表达。这相对于只能依赖自身5LTR启动子的MMLV载体来说是一个巨大的优势。
安全性：慢病*载体系统具备了以下两大特点，因而具有非常高的安全性。
一、病*包装和转导所必需的基因由三个辅助质粒分开表达。
二、5LTR的启动子自失活。因此，在进行病*包装和病*转导的时候不会产生具有复制能力的病*颗粒，使用我们的载体对人体的健康威胁也是最低的。
不足之处
载体容量受限：野生型的慢病*基因组大小约为9.2kb，而在慢病*载体中，病*包装和转导的必要元件约为2.8kb，余下6.4kb的空间容纳客户的目的序列。当病*载体超过以上大小限制，病*的包装滴度将会大大降低。我们的慢病*载体除了可以插入靶基因的序列外，还可以插入启动子和筛选标记等载体元件。如果目的基因和这些载体元件长度超过了6.4kb，病*的产量有可能会明显下降。
技术复杂：使用慢病*载体时，需要在包装细胞中产生活病*，然后测定病*滴度。因此慢病*转染相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。
质粒图谱及组成元件：以过表达hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
3、哺乳动物腺病*表达载体
概述：腺病*载体能高效转导大多数的哺乳动物细胞，并以游离的DNA形式存在于宿主细胞中。该载体系统是把外源基因导入体内的优先使用方法，经常用于基因治疗和疫苗。
腺病*载体来源于诱发普通感冒的腺病*，野生型腺病*基因组是线性双链DNA。
腺病*重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与由包装细胞表达的病*蛋白进一步包装成病*颗粒。
当病*转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病*基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。
市面上常见的腺病*载体都是经过改造优化的，腺病*载体缺失了E1A、E1B和E3区，前两者与病*包装相关（这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中）。因此，腺病*载体包装出来的病*是复制缺陷型的（只能转导靶细胞而不能自我复制），大大提高了生物安全性。
优势
对宿主基因组造成破坏的低风险性：在转导进入靶细胞后，腺病*载体在细胞核保持着游离DNA的状态，可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险，使其成为人类体内实验的理想载体。
超高病*滴度：腺病*可通过再次转导包装细胞而得到大量扩增，从而获得超高滴度病*，慢病*载体、逆转录病*载体和AAV载体都不具有这个特性。我们提供的腺病*滴度可以达到10IFU/ml。
宿主范围广泛：来源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳动物细胞都能被腺病*载体转导，但某些细胞类型则比较难转导。
载体容量大：腺病*能有效包装的基因组上限大小是38.7kb（从5ITR到3ITR）。在除去腺病*包装表达所需主要元件所占用的容量之后，载体具有约7.5kb的装载空间以容纳目的DNA（例如启动子，ORF和荧光标记）。相比起容量为6.4kb的慢病*表达载体，腺病*载体容量更大，能满绝大多数应用要求。
安全性：为了确保腺病*载体的生物安全性，腺病*载体缺失了病*包装所必须的基因（这些基因被整合到包装细胞的基因组）。所以，腺病*载体包装出来的病*是复制缺陷型的，并且只有在包装细胞中才具有复制能力。
不足之处
载体DNA非整合型：腺病*基因组不会整合到靶细胞的基因组中，而是以游离DNA的形式存在，并且随着时间推移逐渐丢失，特别是在分裂细胞中。
难以转导特定类型的细胞：腺病*载体可以转导很多类型的细胞包括非分裂细胞，但对某些特定类型的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、呼吸上皮分化细胞、外周血细胞、神经元和造血干细胞等，却无法进行有效的转导。
较强的免疫原性：活腺病*会在动物体内引起强烈的免疫反应，从而限制了其在体内的某些应用。
技术复杂：使用腺病*载体时，需要在包装细胞中产生活病*，然后测定病*滴度。这些过程技术难度更高，周期更长。
质粒图谱及组成元件：以过表达hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
4、哺乳动物腺相关病*表达载体
概述：腺相关病*（AAV）载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。不同于腺病*，AAV的免疫原性极低，在体内几乎没有致病性，使得AAV成为许多动物研究的理想工具。
AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与辅助质粒表达的病*蛋白进一步包装成病*颗粒。
当病*转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病*基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。
在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中处理AAV。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。
人们已从自然界中鉴定出许多AAV病*株，根据病*表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病*具有不同的组织嗜性（即感染组织特异性）。
优势
安全性：AAV是可供选择的最安全的病*载体，它是复制缺陷的，不会引起任何人类疾病。
对宿主基因组造成破坏的低风险性：在转导进入靶细胞后，AAV病*载体在细胞核保持着游离DNA的状态，可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险，使其成为人类体内实验的理想载体。
高病*滴度：AAV病*载体可以包装成高滴度的病*。
宿主范围广：针对不同来源的常用哺乳动物（如人、小鼠和大鼠）细胞和组织，AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型，可轻易实现高效转导。但是，某些类型的细胞仍然难以转导，这与所用的血清型有关。
体内外实验均有效：载体不仅能用于体内活体动物实验，还具有体外细胞转导能力。
不足之处
载体容量小：AAV是我们所有病*载体系统中装载量最小的。AAV的两个ITR之间所能容纳的最大序列长度是4.7kb，允许使用者插入~4.2kb的目的序列。
难以转导特定类型的细胞：当利用合适的血清型进行包装时，AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞，包括非分裂细胞。不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的亲嗜性，针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。
技术复杂：使用AAV病*载体时，需要在包装细胞中产生活病*，然后测定病*滴度。这些过程相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。
质粒图谱及组成元件：以过表达hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
5、哺乳动物piggyBac表达载体
概述：PiggyBac载体系统可以非常高效地把外源DNA插入哺乳动物细胞的基因组，该系统技术简单，可利用质粒转染（非病*转导）把您所感兴趣的基因长期稳定地整合到靶细胞基因组。
该系统来源于piggyBac转座子，最开始在粉纹夜蛾（Trichoplusiani）中发现并分离而来。基于序列同源性分析，piggyBac转座子是许多常见物种共有的一类转座子。
PiggyBac系统包含两个载体，一个载体被称为辅助质粒，负责编码转座酶；另一个载体被称为转座子质粒，包含两个末端重复序列（TRs）以及两者之间的被转座区域，需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。
当辅助质粒和转座子质粒共转染靶细胞时，辅助质粒产生的转座酶将会识别转座子的两个TR元件，然后将被转座区和两个TR元件插入到宿主基因组中。转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点，并在转座子两侧出现TTAA重复序列。
PiggyBac属于II类转座子，通过“剪切—粘贴”的机制移动，从一个地方转座到另一个地方，而不留下序列本身（恰好相反，I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动）。由于辅助质粒是通过瞬时转染进入宿主细胞的，故会逐渐丢失。随着辅助质粒的丢失，转座子在宿主基因组中变成了永久整合。当这些宿主细胞再次被辅助质粒转染，整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。
优势
外源基因的永久整合：常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反，将piggyBac转座子载体和辅助质粒一起转染到哺乳动物细胞中，由于转座子在转座酶的作用下，目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中，从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。
技术简单：通过常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病*载体需要进行病*包装，过程更简单。
载体容量大：我们的转座子载体总容量可达30kb，其中质粒骨架只占3kb，有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。
不足之处
转染细胞类型受限：PiggyBac载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞，其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞更难转染，一些重要的细胞类型转染难度更大，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染主要局限于体外应用，很少应用于体内实验（但可以应用于转基因动物模型制备）。以上因素在一定程度上制约了piggyBac系统的应用。
质粒图谱及组成元件：以过表达hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
6、SleepingBeauty转座载体
概述：睡美人（Sleepingbeauty）转座载体系统可以高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组。该系统在技术上十分简洁，仅需要进行质粒转染（无需病*转导）即可永久性地对宿主细胞基因组插入您的目的基因。
该载体的转座子系统来源于Tc1/mariner转座子超家族，一开始是从鱼类基因组分离出来，并且经过了大量的累积突变已失去转座子活性。睡美人转座子通过移除鲑鱼基因组的Tc1/mariner转座子上的这些失活突变，重新构筑出有活性的转座子。该方法合成的转座子提供了一种在脊椎动物中高效地进行基因转导和插入突变的手段。
睡美人转座载体系统包含两个载体，均为大肠杆菌质粒形式。第一个是辅助质粒，编码转座酶。另一个则是转座子质粒，包含由两个反向/正向重复序列（IR/DR）包围的转座子区域。需要被递送至宿主细胞的外源基因被克隆至该区域。
当辅助质粒和转座子质粒共转染至靶细胞时，辅助质粒表达的转座酶会识别IR/DR序列，然后将两个IR/DR序列之间的区域作为转座子插入宿主基因组上的TA二核苷酸位点。
睡美人转座子是II类转座子，这意味着其遵循剪切-复制的转座机制，从一个地方转移序列至另一个地方不会留下多余的序列拷贝（I类转座子则遵循复制-粘贴机制）。由于辅助质粒是瞬时转染的，会随着时间逐渐丢失。伴随辅助质粒的丢失，插入宿主基因组的转座子将变成永久性的。如果此时再次转染辅助质粒，转座子则可以从宿主基因组中剪切出来，且不会在基因组上留有痕迹。
优势
转座子DNA永久整合：传统的质粒瞬转，转染的质粒再宿主细胞中会逐渐丢失，特别是分裂型的细胞。但是使用睡美人转座子载体连同辅助载体共转染哺乳动物细胞可以实现转座子DNA在宿主细胞基因组的永久整合。
技术简单：常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病*载体需要进行病*包装，过程更简单。
不足之处
可转染的细胞类型受限：不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染局限于体外细胞实验，很少运用到活体实验。这些问题限制了睡美人转座子载体系统的应用。
转座子容量有限：转座子的容量需在1.9–7.2kb之间，超出该长度的转座子其转座效率会降低。
质粒图谱及组成元件：以过表达hIL2为例，荧光蛋白选择EGFP
启动子的分类及应用病*转染实验，该如何选择工具病*什么是腺病*载体，关于腺病*包装你了解多少浅谈mRNA疫苗及其作用原理「1/2」简述mRNA疫苗生产工艺流程