ATP检测发光法是比色法、荧光法和放射性同位素法的一种替代方法，可用于定量评价培养的哺乳动物细胞的增殖和细胞*性。这里测试的所有三种ATP检测发光分析都是均相的、免洗，适合96孔和孔，使它们成为细胞增殖和细胞*性高通量筛选的理想方法。在这些检测中，培养中活细胞的数量是通过定量ATP来确定的。ATP是细胞活力的标志，因为它存在于所有代谢活性的细胞中，因此，ATP的数量与培养中活细胞的数量成正比。如果细胞数量因增殖而增加，那么ATP的数量就会增加；如果细胞数量因细胞死亡而减少，则ATP的数量就会减少。从裂解细胞中释放的ATP在氧气的存在下与荧光素底物、荧光素酶和镁反应产生光，反应原理如下所示。然后使用酶标仪luminescence模块对发射的光进行量化，由此测量的发光信号与样品中ATP的数量成正比。材料和方法细胞培养和处理采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)，取自两个献血的健康个体。细胞被置于白色96孔TC处理的96孔培养板，在RPMI-培养基中，添加10%胎牛血清和2mml-谷氨酰胺。标准品制备，建立光强度与ATP浓度关系，冻干ATP标准品用水溶解为浓度10nM，使用培养基3倍6个梯度连续稀释最大浓度为1.25M。为了建立处理细胞时的线性范围，对PBMCs进行2倍8个梯度连续稀释，每孔最大密度为2.5xPBMCs。实验开始前，细胞在37°C,with5%CO2中孵育1小时。观察细胞*性，PBMC细胞以每孔1x个细胞的密度布孔。在1g/ml抗CD3和1g/ml抗CD28的存在下，对DMSO进行2倍、7点连续稀释至最大浓度为10%。处理后的细胞在37°C，5%CO2培养96小时。观察细胞增殖，PBMC细胞以每孔1x个细胞的密度布孔。将抗CD3和抗CD28进行2倍、9点的连续稀释至最大浓度为4g/ml（每个抗体）。处理后的细胞在37°C，5%CO2培养96小时。ATP检测细胞分析我们评估了三种ATP检测方法：ATPlite1Step，ATPlite以及同类型商品三种检测方法。所有试剂均按照制造商的说明书制备。结果与讨论ATP标准曲线测定对ATP的敏感性是通过检测ATP的连续稀释度(3倍，最大1.25M)来确定的。对于三种试剂盒，ATP检测在从~1nM到1M的三个量级上都是线性的。在这个动态范围内，试剂盒之间的检测比保持不变。ATPlite1step试剂盒显示了最大的信噪比(S/B)。这种优越的检测窗口表明了对ATP的高灵敏度，允许可靠地检测ATP浓度的微小变化。ATPlite检测获得的较低信号强度，相应稳定较好，长达5小时的半衰期，而其他检测试剂盒应在添加试剂后30分钟内读取。对人PBMCs产生的内源性ATP的敏感性通过检测PBMC悬浮液的连续稀释度(2倍，2.5xPBMCsmax)，来测定其对人PBMCs产生的ATP的敏感性。ATP检测在两个数量级上呈线性变化，从1.9x到2.5xPBMCs。ATPlite1step试剂盒检测的ATP的灵敏度最高。根据标准曲线，发光可以转化为ATP浓度，2.5xPBMCs对应2.5x10-7MATP(donorA)和4x10-7MATP(donorB)。与donorB相比，donorA的回归斜率较小，这表明了供体特异性的差异，即donorB的PBMCs在代谢上比donorA的PBMCs更活跃。这些结果表明，PBMC的数量反映在三种ATP检测发光法检测到的ATP的数量上。PBMC细胞*性检测DMSO被用作诱导人骨髓瘤细胞*性的化合物，增加DMSO浓度，与PBMCs孵育96小时，导致发光信号下降，反映出DMSO存在时细胞活力受损。通过ATPlite1step获得了最大的检测窗口。这从donorA的曲线斜率可以看出，donorA的PBMCs对DMSO的反应比donorB的PBMCs更敏感。这些结果表明，诱导的PBMC细胞死亡导致ATP的减少，三种ATP检测试剂盒都可以检测到，能够检测到相似的供体特异性差异。PBMC增殖检测以抗CD3/抗CD28抗体组合作为诱导PBMCs细胞增殖的试剂。随着抗CD3/抗CD28浓度的增加，发光信号增加，反映了诱导的细胞增殖。与预期的一样，来自donorA的EC50值较高。当donorA的PBMCs在0.g/ml抗CD3/抗CD28时达到最大增殖能力时，当donorBPBMCs对4g/ml抗CD3/抗CD28的增殖反应增加，但没有达到平台期。这些结果表明，诱导的PBMC增殖导致ATP的增加，ATP检测试剂盒具有较高的灵敏度。结论结果表明，ATPlite1step在S/B比表现良好。ATPlite可能用于检测同质细胞群较高ATP浓度下的ATP变化；虽然它产生的光强度较低，但它的优点是提供一个随时间更稳定的信号（半衰期4小时），这在工作流程中提供了更多的灵活性。ATPlite1step的高S/B比和一步法简单的操作流程，成为检测原代人PBMCs细胞增殖和细胞死亡的优秀检测技术。ATPlite1step特点与优势①高灵敏度、宽动态范围：每孔可检测数个至数万个细胞。②无需洗涤：MixMeasure匀相检测技术使检测步骤更少。③长时间发光：发光信号持续时间长，可进行连续处理或批处理。相关推荐
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ATP检测使用酶标仪luminescence模块，推荐PerkinElmerVICTORNivo多功能酶标仪：