#circRNA#
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前言
DanielG.Anderson构建了外源CircRNAConstruct用于真核细胞表达外源蛋白，但想要将体外构建的CircRNA导入人体细胞内，应用于疫苗或者抗体药物，面临的首要问题是：外源CircRNAConstruct是否会触发人体的免疫反应？如果触发人体免疫反应，我们应该采取什么样的手段去避免机体对于外源CircRNA的免疫反应？今天，菌菌主要给大家采集整理了这方面的信息，供大家参考。
一直以来，科研工作者的视野都聚焦在各类大分子上，蛋白组学、代谢组学等各类研究经久不衰。近年来，随着高通量测序技术及生物信息学的快速发展，非编码RNA逐渐走入人们视野。其中的环状RNA被证实具有多种分子机制，包括调控基因的转录和翻译，调控蛋白质互作甚至可以被翻译成小肽，可见circRNA在生物和生物医学领域的研究越来越热。
星耀小TIP：
环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子（在活体中有时也表达），也是RNA领域最新的研究热点。circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNAsponge)的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。
一、细胞内外源核酸Sensors
谈及细胞内外源核酸Sensors，首先我们需要了解一点免疫学知识，天然免疫（innateimmunesystem）是哺乳动物免疫系统抵抗病原微生物入侵的第一道防线，机体通过模式识别受体（patternrecognitionreceptors）来识别病原体相关的模式分子（pathogen-associatedmolecularpattern）。
病原体相关的模式分子是病原微生物（细菌和病*）所共有的一些结构保守的模式分子，比如蛋白，核酸，LPS等，一旦细胞内的模式识别受体结合，通过级联反应，可以激活机体的天然免疫反应,表达分泌I型干扰素，发挥抗病*效应。
细胞内的核酸感受器主要可以分为以下2种：
DNASensors：
§cGAS-Sting（longdouble-strandedDNAorshortformsofdouble-strandedDNAwithsingle-strandedoverhangscontainingGs）
§TLR9(single-strandedDNAcontainingunmethylatedCpGdinucleotides)
§AIM2(longdouble-strandedDNA)
RNASensors:
§TLR3(longdouble-strandedRNA)
§TLR7(double-strandedandcontainingGandU)
§TLR8(single-strandedRNA)
§RIG-I(atleastashortdoublestrandwithabluntendanda50-triphosphate.)
§MDA5(double-strandedRNA)
图1细胞内外源核酸Sensors
二、线性mRNA刺激机体免疫反应
早在年，KatalinKarikó（第一位获得德国医学奖的匈牙利研究人员，研发出了新冠肺炎疫苗）就发现不同类型的RNA刺激诱发DC细胞免疫反应的程度是不同的，RNA修饰程度越高，DC细胞受到的免疫刺激越弱。
相比于体外转录mRNA刺激DC细胞分泌的TNF-α水平，Katalin发现哺乳动物细胞totalRNA，细胞核RNA，细胞质RNA，mRNA-polyAtail刺激DC细胞分泌的TNF-α水平均在一个非常低的水平，两者差异非常显著。哺乳动物线粒体RNA(mitochondrial)和细菌totalRNA强烈刺激DC细胞分泌的TNF-α，这是由于哺乳动物线粒体RNA和细菌totalRN在结构上有着更多的相似性——有着比较少的化学修饰。
对于化学修饰较多的tRNA，不管是哺乳动物tRNA，还是细菌tRNA，相比较其他类型化学修饰较少的RNA，刺激DC细胞分泌的TNF-α水平发生了显著下降。接着，Katalin利用修饰核苷酸（m5C,m6A,m5U,s2U,orpseudouridine）体外转录合成mRNA，转染能够稳定表达TLR受体的细胞，通过检测细胞分泌的IL8水平来判断外源mRNA对于TLR的激活，试验数据表明，利用化学修饰核苷酸合成出来的mRNA能够避免被TLR受体识别，从而消除细胞免疫反应。Katalin此篇文章扫除外源mRNA导入人体细胞进行蛋白表达的一个关键性障碍，成为mRNA疫苗研发史上一个标志性事件。
图2修饰核苷酸消抑制细胞TLR识别外源RNA
星耀小TIP：白细胞介素-8（IL-8），是趋化因子家族的一种细胞因子，在参与和调节人类生殖生理和病理过程的作用已得到肯定，其作用机制之一就是与其特异性受体结合而发挥作用。白细胞介素-8可对炎症反应进行有效调节，可促血管生成。在小支气管炎和囊性纤维化的发病中IL-8也起了重要作用。
三、外源circRNA触发机体免疫反应的争议
那么回到我们最开始的问题：外源circRNAconstruct到底是否会触发机体免反应。针对这个问题，从年7月到年11月，四年多的时间里，三位观点不同的业内大牛在MolecularCell发表了4篇文章来阐释这个问题。
年HowardY.Chang在MolecularCell发表文章首次发现circRNA可以触发细胞天然免疫反应。
年5月DanielG.Anderson在MolecularCell发表文章，拿到了非常漂亮的数据，提出完全相反的观点，宣称外源circRNA并不会触发机体天然免疫反应，并且指出HowardY.Chang可能是在制备circRNA的时候，纯化没有做到位，混入了线性RNA，因此得出错误论。DanielG的操作可谓是毫不留情面，直言HowardY.Chang的试验操作有问题。有意思的是，DanielG基于此前circRNA构建和circRNA免疫反应的两篇文章，同年（年）申请了专利（WO236673A1）。
但戏剧性的一幕发生了，仅过五个月，HowardY.Chan紧随其后，同样在MolecularCell发表文章，对DanielG质疑样品制备有问题毫不客气地进行回怼，指出DanielGcircRNA样品纯化处理还没有自己做的细致严谨。既然DanielG说混入了5triphosphorylatedlinearRNA，为了消除DanielG的猜忌，表明自身的实验操作并无问题，HowardY.Chan该篇文章所有的circRNA完成环化以后，全部使用磷酸酶（phosphatase）处理，从circRNA样品中彻底移除掉linear5phosphorylatedRNAs，试验结果依旧证明circRNA可以触发细胞天然免疫反应，并且有了新的发现，未经修饰的circRNA可以作为非常好的佐剂来触发机体产生抗原特异性的TandBcellresponse，只有经过化学修饰的N6-methyladenosine(m6A)circRNA才可以抑制机体的天然免疫反应。
星耀小TIP：
磷酸酶（phosphatase）通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，将对应底物彻底去磷酸化。
两年以后，中科院生化细胞所陈玲玲在发现两位大牛的观点各有千秋后，也进行试验加入了这场论战。
陈琳琳发现，不同方式构建的circRNA会触发不同程度的免疫反应，采用groupIintrons构建的circRNA会触发机体免疫反应，而通过T4RNAligase构建的cicRNA对细胞免疫反应的刺激非常弱。但年HowardY.Chang的文章中就测试过T4RNAligase构建的cicRNA，试验数据却展示T4RNAligase构建的cicRNA很强烈地触发了细胞天然免疫反应。
到此相信大家也看得云里雾里，一知半解，大牛们观点各异，数据都漂亮可陈，却相互驳斥。那么让菌菌带领大家详细看看三位大佬发表的4篇文章，看看是否能够找到一些解开这个难题的蛛丝马迹。
四、-HowardY.Chang——circRNA可以触发细胞天然免疫反应
在年，HowardY.Chang在MolecularCell发表文章《SensingSelfandForeignCircularRNAsbyIntronIdentity》，他分析试验数据，得出以下结论：
·外源circRNA能够强烈触发细胞的免疫信号
·被外源circRNA转染的细胞抗病*能力增强
·细胞通过内含子序列来区分自身circRNA和外源circRNA
·成熟的人源circRNA经常和不同的RNA-Binding蛋白结合，将其标记为自身circRNA
图3外源circRNA与自身circRNA的流程图解
1.HowardY.ChangcircRNA环化方法：
通过ThegroupIintronofphageT4thymidylatesynthase(td)gene来构建外源circRNA，由CMVIRES来启动GFP蛋白的翻译表达。通过qPCR的方法来评估成环效率，divergentprimers可以检测circRNA，convergentprimers可以检测circRNA和linearRNA。
2.HowardY.ChangcircRNA纯化方法：
环化反应完成后，用RNaseR处理消除线性片段，用phosphatase处理消除5phosphates。
图4HowardY.ChangcircRNA制备纯化方法
3.外源circRNA可以刺激细胞天然免疫相关基因的表达
HowardY.Chang构建外源circRNA本意是想作为外源蛋白表达的载体，但他用外源circRNA转染HeLacells后，细胞内GFP蛋白表达量很低，并且未展示相关数据。比较他跟年DanielG发表在NC上的文章可以发现，HowardY.Chang构建的外源circRNA序列中似乎没有放入两个exon序列，且GFP序列和IRES序列前后顺序也有差异。但HowardY.Chang发现了外源circRNA具有非常强烈的免疫刺激效应，并且证实RIG-I是外源circRNA的胞内Sensors。
图5RIG-IIsNecessaryandSufficienttoSenseExogenousCircRNA
4.排除circRNA制备过程存在的副产物污染引起天然免疫的猜测
由于已知的RIG-I的配体是含有5triphosphate的RNA，因此HowardY.Chang用phosphatases处理circRNA，消除掉可能存在的末端5triphosphate，结果发现用phosphatases处理过的circRNA依然可以触发细胞天然免疫反应。接着，又测序证实构建的circRNA并不含有非常长的双链互补区域（longdsRNAduplex）。然后发现，通过连接酶方式产生的circRNA也会触发细胞天然免疫反应。最后，用RNaseH线性化处理circRNA，能够消除免疫刺激效应，彻底证实细胞天然免疫反应确实是由circRNA引起的，而不是环化反应中存在的其他副产物造成的。
图6circRNA用phosphatases处理后的数据展示
五、-DanielGAnderson——circRNA不能触发细胞天然免疫反应
年5月，DanielG.Anderson在MolecularCell发表文章《RNACircularizationDiminishesImmunogenicityandCanExtendTranslationDurationInVivo》，针对cricRNA免疫反应性和体内蛋白表达，得出以下结论：
·环化反应过程产生的TriphosphorylatedandlinearRNAcontaminants触发细胞的天然免疫反应
·纯化的circRNA不会触发RIG-I介导的天然免疫反应
·纯化的circRNA不会触发TLR介导的天然免疫反应
·LNP包裹的circRNA可以在小鼠组织内表达外源蛋白
图7cricRNA免疫反应性和体内蛋白表达图解
1.DanielG.AndersoncircRNA环化方法
DanielG.Anderson采用优化的基于thepermutedAnabaenapre-tRNAgroupIintron的circRNA构建方法，组成circRNAprecursors序列的元件包括：CVB3IRES；GLucCDS序列；spacersequences；同源序列；exon序列。可以看到DanielG.Anderson构建的circRNA序列组成要比HowardY.Chang更加复杂。
图8circRNA基于thepermutedAnabaenapre-tRNAgroupIintron的构建方法
2.DanielG.AndersoncircRNA纯化方法
为了确保circRNA的纯度，DanielG.Anderson在完成环化反应以后，对环化反应的产物进行了一系列连续处理，RNaseR富集circRNA，HPLC移除非环化组分，phosphatase移除残留的末端triphosphates。然后，将纯化后的circRNA转染细胞，检测细胞因子的分泌。由于在细胞中不含由几个关键的RNAsensors，因此没有检测到细胞因子的分泌。但在A细胞中，发现随着纯化方法的不断提升，cicrRNA引起的免疫反应逐渐减少消失，说明circRNA纯度是造成细胞天然免疫反应的关键因素。
图9circRNA纯化转染情况
3.分析环化反应的各组分对于细胞天然免疫反应的影响
环化反应产物的各组分主要包括：高分子量组分（linearandcircularconcatenations），circRNA（为防止同nickedRNA峰的重叠，收集组分了earlycircRNA和latecircRNA），nickedRNA，precursorRNA，Introns。
图10通过HPLC分离环化反应的各组分
为了找到环化反应产物中究竟是哪些组分引起细胞天然免疫反应，DanielG.Anderson用HPLC分离环化反应产物中的各组分，转染A细胞，检测细胞因子分泌水平。结果发现，latecircRNA不会触发细胞免疫反应，但是earlycircRNA由于混入了少量linearRNA，触发了明显的细胞免疫反应。在A细胞中，与latecircRNA相比，未经纯化的环化反应产物，线性化的precursorRNA（剪切位点突变的△SpliceSites）会刺激RIG-I基因和IFNβ基因的表达上调，由此得出circRNA并不是RGI-I的天然配体，这与年HowardY.Chang得到的结论完全是相反的。
图11细胞天然免疫反应是由环化反应中的其他组分引起的
DanielG.Anderson用RNaseR处理环化反应产物，转染A细胞后，与latecircRNA相比，并不能消除细胞免疫反应，说明RNaseR处理环化反应产物无法消除全部的线性RNA，可能有残留。
图12RNaseR处理环化反应产物，转染A细胞柱状图
4.修饰核苷酸对circRNA免疫刺激反应和蛋白翻译的影响
将circRNA中的尿嘧啶全部用N1-Methylpseudouridine替换，会抑制I型Introns的剪切活性，阻断环化反应的发生。如果采用连接酶的方式来构建circRNA，那么此种替换，不会影响环化反应的发生。把未经修饰的circRNA和N1-Methylpseudouridine修饰的circRNA转染细胞，结果发现N1-Methylpseudouridine修饰的circRNA居然丧失蛋白翻译表达能力。未经修饰的线性mRNA，尽管经过加帽，加尾巴，phosphatase处理，HPLC纯化，移除RIG-I配体，但是同未经修饰的circRNA相比，依然会刺激细胞产生强烈的免疫反应。
图13circRNA转染细胞和A细胞，检测Gluc表达水平和各自细胞因子表达水平
此外，DanielG.Anderson还研究了m6A对于circRNA蛋白翻译表达的影响，构建GLuc-codingcirc△IRES（去除掉IRES，起始密码子上游区域为富含A的序列），结果发现，与未经修饰的circRNA相比，m6A-circRNA蛋白翻译表达能力居然发生了下降，m6A-circ△IRES基本上检测不到表达蛋白的活性。这些数据说明，不管是从蛋白表达效率还是刺激细胞引发免疫反应来说，外源circRNA似乎并不能从修饰核苷酸获得更好的性能提升。
图14circRNAs转染细胞，检测Gluc表达水平
5.circRNA可以逃脱TLR识别
DanielG.Anderson研究了不同类型的RNAs对TLR的激活。所有的线性RNAs（capped-mRNA，polyadenylatedmRNA，N1-Methylpseudouridine-mRNA），用phosphatase处理，HPLC纯化。结果发现，线性RNAs和circRNAs无法激活TLR7，但是cappedlinearizedRNA，polyadenylatedlinearizedRNA，thenickedcircRNA，theearlycircRNA可以激活TLR3和TLR8，只有ThelatecircRNA和N1-Methylpseudouridine-mRNA在任何类型细胞中都不能触发TLR-mediatedresponse。这就说明，只要circRNA足够纯，不混入其他的杂质，可以避免被细胞内的TLR识别。
图15各自类型的RNAs转染TLRReportcells，检测SEAP表达水平
6.外源circRNA在小鼠体内的蛋白表达能力和免疫原性
DanielG.Anderson把circRNA导入小鼠体内，发现circRNA在小鼠体内蛋白表达能力是优于N1-Methylpseudouridine-mRNA的，而且也不会触发免疫反应。
图16把circRNA和线性mRNA导入小鼠体内，检测血清当中hEpo表达水平，检测血清当中各自细胞因子表达水平变化
六、-HowardY.Chang-m6A化学修饰调控circRNA免疫原性
年10月，HowardY.Chang又在MolecularCell发表文章《N6-MethyladenosineModificationControlsCircularRNAImmunity》，得到与DanielG.Anderson相反的观点，继续坚定地认为circRNA就是可以触发免疫反应：
·未经修饰的circRNA可以作为一种佐剂，触发抗原特异性的T细胞和B细胞反应
·m6A化学修饰将circRNA标记为自身circRNA，阻断circRNA免疫原性
·未经修饰的circRNA结合RIG-IandK63-PolyubiquitinChain，启动天然免疫反应
·YTHDF2结合m6A-circRNA，抑制circRNA免疫原性
图17circRNA可触发免疫反应示意图
1.circRNA酶法纯化
HowardY.Chang首先阐述年文章中circRNA标准酶法纯化方法：环化反应完成以后，用RNaseR处理2h以上，降解线性副产物，然后用alkalinephosphatase处理移除掉末端5phosphate。他认为，相比较线性RNA用phosphatase处理可以降低细胞免疫反应，用标准方法纯化获得的circRNA接着用phosphatase再处理一遍，circRNA对于细胞的免疫刺激反应没有任何改善。因此，他认为circRNA对于细胞的免疫刺激反应与样本中存在异常的5triphosphates无关。
接着，他认为如果circRNA样本存在线性RNA组分，那么由于具有不同的分子量，可以通过胶回收去除这些线性组分。他比较了胶回收纯化的circRNA和标准酶法纯化的circRNA对于细胞的免疫刺激反应，结果发现两者没有区别。
图18胶回收纯化和酶法纯化获得的circRNA刺激天然免疫相关基因的表达
最后，HowardY.Chang用HPLC分离RNaseR处理的circRNA，有两个收集峰，这与DanielG.Anderson获得的HPLC峰图是不相同的，HowardY.Chang认为这种差别可能是由于不同仪器造成的。两个组分转染细胞后，都能够刺激细胞天然免疫相关基因的表达。
HowardY.Chang认为从circFOREIGNintegrity的角度来看，酶法纯化胶回收HPLC，因此这篇文章还是采用标准的酶法纯化。与DanielG.Anderson关于circRNA免疫原性结论的反差，HowardY.Chang认为这可能是由于circRNA序列的差别，转染细胞的差别所引起的，跟纯化方法关系不大。
图19酶法纯化柱状图
2.circRNA可以作为疫苗佐剂和具有抗肿瘤效应
HowardY.Chang将CircFOREIGN（GFPcricRNA）和OVA通过皮下注射打入小鼠体内，结果发现CircFOREIGN可以强有力地诱导OVA-specificCD8+Tcells和OVA-specificantibodies生成。无须转染试剂，裸CircFOREIGN就可以实现此种效果。
使用OVA抗原和CircFOREIGN接种小鼠，可以减少OVA-expressingtumors的形成，因为CircFOREIGN诱导生成的OVA-specificCD8+Tcells可以限制OVA-B16melanoma模型的建立。这些数据说明CircFOREIGN的免疫原性可以用于临床治疗。
图20使用OVA抗原和CircFOREIGN接种小鼠的模型流程图
3.机体通过m6A化学修饰区分self-circRNA和CircFOREIGN
哺乳动物细胞内也存在很多内源性的circRNA，机体对于CircFOREIGN免疫反应性，说明机体可以区分内源性的circRNA和外源性的circRNA。这种区分机制很可能依靠的是化学修饰，m6A是最丰富的RNA化学修饰，因此他测定了与内源性circRNA和外源性circRNA结合的m6A相关的蛋白分布情况，结果发现内源性circRNA经常和m6Awriter