中科检测是独立第三方检测机构，具备开展病*杀灭试验的生物安全等级2级（P2）实验室，可开展消*器械、消*剂、抗菌材料等产品的病*灭活验证试验。本文详细介绍了新冠病*灭活试验的具体方法和步骤。
新冠病*灭活试验：试验器材
1、试验病*与细胞
试验病*为分装保存并确定病*滴度的新型冠状病*培养物，细胞株为非洲绿猴肾传代细胞（VeroE6）或其它适合用于新型冠状病*增殖培养的细胞系。
2、有机干扰物
牛血清白蛋白。
3、试剂
消*因子、中和剂、细胞消化液、细胞维持液和细胞培养液等。
4、仪器
二氧化碳培养箱、倒置显微镜、冰箱、水浴箱、II级或II级以上生物安全柜等。
5、耗材
无菌带滤芯tip头、吸管、离心管、冻存管、试管、多孔细胞培养板、单道移液器、多道移液器等。
6、载体
可选用布片、玻璃片、不锈钢片等。
新冠病*灭活试验：细胞准备
实验所用Vero-E6细胞或其它细胞在细胞培养室常规传代培养，置二氧化碳培养箱（36℃±1℃，5%±1%二氧化碳）中培养至单层细胞备用。
新冠病*灭活试验：病*悬液的制备
取出-80℃低温保存的新型冠状病*，室温解冻后，与设定浓度的有机干扰物混合作为消*剂灭活试验用病*悬液。
新冠病*灭活试验：载体的制备
1、载体应根据消*对象选择相应的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不锈钢片等，金属载体一般用12mm直径圆形金属片（厚0.5mm），其他材质载体一般为方形，大小10mm×10mm，特定用途的消*因子可使用其他相兼容材质的载体。
2、所用载体于染病*前，应进行脱脂处理。脱脂过程应严格按照如下步骤进行：
a)将载体放入含洗涤剂的水中煮沸30min;
b)用自来水漂洗；
c)用蒸馏水煮沸10min；
d)用蒸馏水漂洗至pH呈中性；
e)晾干，备用。
3、载体经压力蒸汽灭菌后烘干备用，试验前使用滴染法染病*悬液。
4、滴染载体的病*滴度对数值应≥4.0。
新冠病*灭活试验：中和剂鉴定试验
鉴定试验旨在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病*灭活试验。中和剂鉴定试验包括预试验和正式试验，通过预试验确定消*剂、中和产物和中和剂等对细胞生长有无影响；通过所设各组试验结果综合分析，确定所用中和剂是否对测试消*剂有良好的中和作用，对试验用病*和细胞株是否有害或不良影响；中和试验用消*剂浓度应为正式消*试验最高浓度，作用时间最短不得少于30s。试验重复3次。
新冠病*灭活试验：试验步骤
新冠病*灭活试验原理，是用细胞感染法测定消*因子作用前后（或对照组与实验组）样本中病*的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病*的感染滴度，观察消*因子对新型冠状病*的灭活效果。
1、悬液法病*灭活试验
a)取待测消*剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。
b)病*悬液的制备：取出-80℃低温保存的新型冠状病*，室温解冻后，与有机干扰物按照1:1比例混合作为消*剂灭活试验用病*悬液。
c)消*试验：取上述病*悬液1份加入4份待检消*剂，立即混匀并记时。作用至规定时间，立即取出0.1mL，加入经鉴定合格的0.9mL中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。
d)对照组试验：阳性对照组为病*对照组，观察病*生长是否良好，病*滴度是否达到试验要求；阴性对照组用细胞维持液作为阴性对照，观察有无污染，细胞生长是否良好。
e)以上各组按照终点稀释法分别进行病*滴度测定。试验重复3次。
f)终点稀释法：用细胞维持液对待滴定样本做10倍系列稀释，吸取样液μL，接种于单层细胞培养板上，每个滴度接种4孔。在36℃±1℃放置1h～2h后，取出培养板，更换细胞维持液。继续放入二氧化碳培养箱中（36℃±1℃,5%±1%二氧化碳）培养3-4天，显微镜下观察细胞生长状态，记录细胞病变情况。
2、载体法病*灭活试验
a)取待测消*剂，置于20℃±1℃水浴中备用。
b)病*载体的制备：取灭菌载体片，滴染新型冠状病*晾干备用。
c)消*试验：取病*载体置于消*因子，作用至规定的时间后取出放入经鉴定合格的中和剂或洗脱液1.0mL中，作用10min,混匀洗脱。消*器械载体布点应置于最难杀灭部位，具体方法参照《消*技术规范》。
d)对照组试验：阳性对照组为病*对照组，观察病*生长是否良好，病*滴度是否达到试验要求；阴性对照组用细胞维持液作为阴性对照，观察有无污染，细胞生长是否良好。
e)以上各组按照终点稀释法分别进行病*滴度测定。试验重复3次。
f)终点稀释法：用细胞维持液对待滴定样本做10倍系列稀释，吸取样液μL，接种于单层细胞培养板上，每个滴度接种4孔。在36℃±1℃放置1h～2h后，取出培养板，更换细胞维持液。继续二氧化碳培养箱中（36℃±1℃,5%±1%二氧化碳）培养3-4天，显微镜下观察细胞生长状态，记录细胞病变情况。
新冠病*灭活试验：结果评价
同时符合下列a)和b)的消*因子判为消*效果合格：
a)去除残留消*剂效果的中和剂鉴定试验合格；
b)悬液灭活试验，每次试验对新型冠状病*应有效灭活，阳性对照组病*滴度对数值应≥5.0或载体灭活试验，每次试验对新型冠状病*应有效灭活，阳性对照组病*滴度对数值应≥4.0。